βサラセミア治療薬を目指すCHTOPを標的としたスプライシング阻害剤の探索

Research Project

Project/Area Number	18K05350
Research Category	Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
Allocation Type	Multi-year Fund
Section	一般
Review Section	Basic Section 37030:Chemical biology-related
Research Institution	Tokyo University of Agriculture and Technology
Principal Investigator	泉川桂一東京農工大学, (連合)農学研究科(研究院), 特任助教 (60625713)
Project Period (FY)	2018-04-01 – 2019-03-31
Project Status	Discontinued (Fiscal Year 2018)
Budget Amount *help	¥4,420,000 (Direct Cost: ¥3,400,000、Indirect Cost: ¥1,020,000) Fiscal Year 2020: ¥1,040,000 (Direct Cost: ¥800,000、Indirect Cost: ¥240,000) Fiscal Year 2019: ¥1,690,000 (Direct Cost: ¥1,300,000、Indirect Cost: ¥390,000) Fiscal Year 2018: ¥1,690,000 (Direct Cost: ¥1,300,000、Indirect Cost: ¥390,000)
Keywords	スプライシング / CHTOP / サラセミア / γグロビン / スクリーニング / βサラセミア / スプライシング阻害剤 / イントロンリテンション
Outline of Annual Research Achievements	本研究は、βサラセミアの新規治療法として有望視されるγグロビン再発現法の確立を目標とし、γグロビンの発現抑制因子であるCHTOPに着目したスプライシング抑制剤を介するCHTOPの発現抑制法を開発すること目的としている。ヒト慢性骨髄白血病細胞株K562においてCHTOP発現低下時のγグロビン発現量の増減を検討した。電気穿孔法でのsiRNAによるCHTOPの発現抑制では、報告されているγグロビンの発現上昇が検出されなかった。赤芽球関連細胞でのCHTOP発現抑制時の効果を検証する必要があると考えられた。また、酪酸ナトリウムを用いたK562細胞の赤血球分化系を利用しCHTOP発現抑制時のヘモグロビン合成を検証した結果、CHTOPはヘモグロビン合成に影響を及ぼさないことが示唆された。次に、CHTOP pre-ｍRNAのスプライシングを感知するスクリーニング系の作製に着手した。CHTOPのmRNAはエクソン（Ex）１からEx６までで構成され、Ex２とEx３に挟まれたイントロン（Int）２がスプライシングされるとmRNAは正常に発現するが、スプライシング抑制によりInt2が残留すると、mRNA分解が誘導されCHTOPの発現量が低下する特徴がある。この特異なメカニズムを利用し、Int２のスプライシング抑制を促す薬剤を探索するためのスクリーニング系を考案した。NanoLucルシフェレースの遺伝子配列の上流にCHTOPのEx１、Ex2、Int2、Ex3、Ex4遺伝子領域を有するミニ遺伝子を構築し、これを用いたin vivoスプライシングアッセイにより、ミニ遺伝子に由来するリポーター（NanoLuc）の発現システムがCHTOPの発現量を示す指標として機能することを示し、CHTOP pre-ｍRNAに対するスプライシング抑制剤のスクリーニング系として利用可能であることを示した。