Studies on the pathogenesis of the hepatitis induced by microbiota via ROS

• Project/Area Number: 18K06976
• Research Category: Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
• Allocation Type: Multi-year Fund
• Section: 一般
• Review Section: Basic Section 49010:Pathological biochemistry-related
• Research Institution: Institute of Physical and Chemical Research
• Principal Investigator: 小嶋 聡一 国立研究開発法人理化学研究所, 生命医科学研究センター, ユニットリーダー (10202061)
• Project Period (FY): 2018-04-01 – 2020-03-31
• Project Status: Discontinued (Fiscal Year 2018)
• Budget Amount: ¥4,550,000 (Direct Cost: ¥3,500,000、Indirect Cost: ¥1,050,000); Fiscal Year 2020: ¥1,430,000 (Direct Cost: ¥1,100,000、Indirect Cost: ¥330,000); Fiscal Year 2019: ¥1,560,000 (Direct Cost: ¥1,200,000、Indirect Cost: ¥360,000); Fiscal Year 2018: ¥1,560,000 (Direct Cost: ¥1,200,000、Indirect Cost: ¥360,000)
• Keywords: 腸内細菌・真菌 / 核トランスグルタミナーゼ / ROS / 肝障害 / 肝細胞死 / 腸内細菌相 / トランスグルタミナーゼ

Outline of Annual Research Achievements

真菌・細菌感染による活性酸素を介した核トランスグルタミナーゼ活性化／肝障害を評価するため、慢性肝障害モデルを構築し、肝組織を回収してRNAの抽出と組織プロックの作製を行った。RNAサンプルを用いて炎症、酸化ストレスや脂質代謝関連遁伝子の発現をPCRで調べた結果、高脂肪食の負荷によりマクロファ ージの炎症性選伝子Adgrelの発現増加が認められた。さらに、炎症と酸化ストレス関連遺伝子Agdrel、Nlrp3、Tnfα、Cd14、Tlr4、Nox2の発現を指標とし、高脂肪食の負荷によりLPSに対する感受性が高まる傾向が見られた。それに対し、抗炎症サイトカインⅠ110と脂質代謝関連遺伝子Srebplcの変化は見られなかった。
一方、ビフィズス菌など善玉腸内細菌による肝保護作用を評価するため、アセトアミノフェン(APAP)過剰投与に伴う肝ミトコンドリア障害による酸化ストレス性急性肝障害マウスモデルを構築し、肝組織を回収、TUNEL染色により肝細胞死を評価した。細胞表面トランスグルタミナーゼが関与することが知られている肝障害を増悪させる主要因子であるTGF-βの活性化をリン酸化Smad3の免疫染色により評価した。その結果、APAP投与したマウスの肝組織において血漿カリクレイン(PLK)に依存するTGF-βの活性化反応の増加が見られ、酸化ストレスで増大した。PLK阻害剤投与によりAPAPによるTGF-βの活性化及び肝細胞死を改善した。

Current Status of Research Progress

3: Progress in research has been slightly delayed.

Reason

上述のとおり、"ヒトではどのような微生物が同現象を引き起こすのか？またこの現象を抑える腸内細菌は存在するのか？"の評価に用いる2種類の動物モデルを作製できた。
"菌を介したROSが上記現象を引き起こす分子機構と制御方法の解析"は、当初予想していたNrf2の関与があまりないことが判明したため、やや遅れている。

Strategy for Future Research Activity

今年度確立した2種類の動物モデルを用いて、腸内細菌の危険度を知るために、病原性腸内細菌をはじめとした各種腸内細菌を尾静脈注射し、トランスグルタミナーゼの核局在・活性をビオチン化基質、ROSの産生を、蛍光プローブを用いて、それぞれモニターする。各菌種についてROS産生の有無とROSの種類、肝細胞核へのトランスグルタミナーゼ誘導能との関係を検証。
菌を介したROSが上記現象を引き起こす分子機構と制御方法については、ROSを無毒化すると示唆されるサイトグロビンのノックアウトマウスを導入し、内在性ROSが蓄積しやすい特徴を持つ肝細胞（サイトグロビン ノックアウトマウスから初代培養にて取得）を用い、この細胞においてトランスグルタミナーゼの核局在が亢進するか確認、トランスグルタミナーゼの核局在に与える影響をはじめとして詳しい作用とその機構を解析する。
さらに、最終年度は菌静注モデルで菌を介したROS刺激を受けた肝臓において、肝類洞血管を流れる一部の末梢血白血球核トランスグルタミナーゼ量が肝細胞同様に変動するかどうか、その増減が腸内細菌を介したROSによる肝細胞の核トランスグルタミナーゼ量のサロゲートマーカーとして利用可能かを、ビオチン化基質やROS検出蛍光プローブを用いて検証する。

Research Products

• [Journal Article] Inhibition of stearoyl-CoA desaturase-1 activity suppressed SREBP signaling in colon cancer cells and their spheroid growth. (2019)
  • Author(s): Qin, X-Y., and Kojima, S.
  • Journal Title: Gastrointest. Disords. Volume: 1 Issue: 1 Pages: 191-200
  • DOI: 10.3390/gidisord1010014
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] Prevention of hepatocellular carcinoma by targeting MYCN-positive liver cancer stem cells with acyclic retinoid (2018)
  • Author(s): Qin XY, Suzuki H, Honda M, Okada H, Kaneko S, Inoue I, Ebisui E, Hashimoto K, Carninci P, Kanki K, Tatsukawa H, Ishibashi N, Masaki T, Matsuura T, Kagechika H, Toriguchi K, Hatano E, Shirakami Y, Shiota G, Shimizu M, Moriwaki H, Kojima S
  • Journal Title: Proc Natl Acad Sci U S A Volume: 115 Issue: 19 Pages: 4969-4974
  • DOI: 10.1073/pnas.1802279115
  • Peer Reviewed / Open Access / Int'l Joint Research
• [Journal Article] Reply to Yoshida: Liver cancer stem cells: Identification and lipid metabolic reprogramming. (2018)
  • Author(s): Qin, X-Y., Dohmae, N., and Kojima, S.
  • Journal Title: Proc. Natl. Acad. Sci. USA Volume: 115 Issue: 28
  • DOI: 10.1073/pnas.1808740115
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Arachidonic acid suppresses hepatic cell growth through oxidative stress-mediated activation of nuclear transglutaminase. (2018)
  • Author(s): Qin, X-Y., Lu, J., Cai, M., and Kojima, S.
  • Journal Title: FEBS Open Bio Volume: 8 Issue: 10 Pages: 1703-1710
  • DOI: 10.1002/2211-5463.12511
  • Peer Reviewed / Open Access / Int'l Joint Research
• [Journal Article] Prevention of acute liver injury by suppressing plasma kallikrein-dependent activation of latent TGF-β. (2018)
  • Author(s): Li, M., Qin, X-Y., Furutani, Y., Inoue, I., Sekihara, S., Kagechika, H., and Kojima, S.
  • Journal Title: Biochem Biophys Res Commun. Volume: 504 Issue: 4 Pages: 857-864
  • DOI: 10.1016/j.bbrc.2018.09.026
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Histological and biochemical evaluation of transforming growth factor-β activation and its clinical significance in patients with chronic liver disease. (2018)
  • Author(s): Yokoyama, H., Masaki, T., Inoue, I., Nakamura, M., Mezaki, Y., Saeki, C., Oikawa, T., Saruta, M., Takahashi, H., Ikegami, M., Hano, H., Ikejima, K., Kojima, S., and Matsuura, T.
  • Journal Title: Heliyon Volume: 5 Issue: 2 Pages: e01231-e01231
  • DOI: 10.1016/j.heliyon.2019.e01231
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Presentation] TGF-β LAP-DP, a novel biomarker and therapeutic target for liver fibrogenesis and acute liver injury (2019)
  • Author(s): Soichi Kojima
  • Organizer: Nanjing University Lecture
  • Invited
• [Presentation] Role of lipid metabolism reprogramming in the prevention of liver cancer (2019)
  • Author(s): Xian-Yang Qin
  • Organizer: Nanjing University Lecture
  • Invited
• [Presentation] Molecular mechanism by which acyclic retinoid selectively kills MYCN-positive liver cancer stemm cells via nuclear transglutaminase, (2019)
  • Author(s): Soichi Kojima
  • Organizer: Life Sciences 2019: Post-translational modifications and cell signaling
  • Int'l Joint Research
• [Presentation] IN VITRO TRACING PLASMA KALLIKREIN-DEPENDENT TGF-β ACTIVATION IN DIAGNOSIS AND THERAPY OF LIVER DISEASE (2019)
  • Author(s): Xian-Yang Qin, Ikuyo Inoue, Soichi Kojima,
  • Organizer: Nature Conference In Vitro Diagnostics
  • Int'l Joint Research
• [Presentation] レチノイドによるMYCN陽性肝癌幹細胞の選択排除 (2018)
  • Author(s): 秦咸陽、小嶋聡一
  • Organizer: 日本がん分子標的治療学会学術集会
• [Presentation] Molecular mechanism by which acyclic retinoid selectively kills MYCN-positive liver cancer stem cells (2018)
  • Author(s): Soichi Kojima
  • Organizer: The Fourth International FASEB Conference on Retinoids
  • Int'l Joint Research / Invited
• [Presentation] Multi-omics analyses on the effect of acyclic retinoid in selective depletion of liver cancer stem cells (2018)
  • Author(s): Xian-Yang Qin, Soichi Kojima
  • Organizer: The Fourth International FASEB Conference on Retinoids,
  • Int'l Joint Research
• [Presentation] 肝発癌における不飽和脂肪酸の役割に関する検討 (2018)
  • Author(s): 秦咸陽、小嶋聡一
  • Organizer: 第25回肝細胞研究会
• [Presentation] アカデミア創薬の取組み－肝臓病の予防/診断/治療薬研究－ (2018)
  • Author(s): 小嶋聡一
  • Organizer: 第18回関西肝血流動態・機能イメージ研究会
  • Invited
• [Presentation] Gut dysbiosis, nuclear transglutaminase and hepatocyte death (2018)
  • Author(s): Soichi Kojima
  • Organizer: The 13th International Symposium on ALPD and Cirrhosis
  • Int'l Joint Research / Invited
• [Presentation] 非環式レチノイドによるタンパク質架橋酵素トランスグルタミナーゼ２の立体構造変化の誘導 (2018)
  • Author(s): 小嶋聡一、関原早苗、秦咸陽
  • Organizer: 日本レチノイド研究会 第29回学術集会
• [Presentation] Role of Unsaturated Fatty Acid-Associated Metabolic Changes in Preventing Hepatic Tumorigenesis (2018)
  • Author(s): Soichi Kojima, Xian-Yang Qin
  • Organizer: AASLD The Liver Meeting 2018
  • Int'l Joint Research
• [Presentation] FibrogenesisマーカーTGF-βLAP-Dの基礎から臨床への応用 (2018)
  • Author(s): 小嶋聡一
  • Organizer: 第32回肝類洞壁細胞研究会学術集会
  • Invited
• [Remarks] 理化学研究所 生命医科学研究センター研究室紹介 肝がん予防研究ユニット
  • URL: http://www.ims.riken.jp/labo/74/index_j.html
• [Remarks] RIKEN, IMS, Liver Cancer Prevention Research Unit
  • URL: http://www.ims.riken.jp/labo/74/index.html
• [Remarks] 理化学研究所 研究紹介 肝がん予防研究ユニット
  • URL: http://www.riken.jp/research/labs/ims/liver_cancer_prev_res/
• [Remarks] RIKEN, Liver Cancer Prevention Research Unit
  • URL: http://www.riken.jp/en/research/labs/ims/liver_cancer_prev_res/