動物由来成分を排除可能なヒト人工染色体ベクター構築法の開発

Research Project

Project/Area Number	18K15671
Research Category	Grant-in-Aid for Early-Career Scientists
Allocation Type	Multi-year Fund
Review Section	Basic Section 52050:Embryonic medicine and pediatrics-related
Research Institution	Tokyo University of Pharmacy and Life Science
Principal Investigator	宇野愛海東京薬科大学, 生命科学部応用生命科学科, 助教 (30733357)
Project Period (FY)	2018-04-01 – 2021-03-31
Project Status	Granted (Fiscal Year 2018)
Budget Amount *help	¥4,160,000 (Direct Cost: ¥3,200,000、Indirect Cost: ¥960,000) Fiscal Year 2020: ¥1,560,000 (Direct Cost: ¥1,200,000、Indirect Cost: ¥360,000) Fiscal Year 2019: ¥1,300,000 (Direct Cost: ¥1,000,000、Indirect Cost: ¥300,000) Fiscal Year 2018: ¥1,300,000 (Direct Cost: ¥1,000,000、Indirect Cost: ¥300,000)
Keywords	ヒト人工染色体 / 微小核細胞融合法 / iPS細胞
Outline of Annual Research Achievements	最大800文字（1600バイト）、改行は5回まで入力可。ただし、一時保存の際は1600文字（3200バイト）まで入力できます。（全角文字は2バイト、半角文字は1バイトと換算 Animal-free HACを構築するため、Chr.X q　及び、Chr.7 q armのセントロメア近傍を標的としたCRISPR/Cas9発現ベクターの構築を行い、活性評価を実施した。また、各染色体を切断するために、人工テロメア付加ベクターにそれぞれの染色体に対する、相同組み換え配列2.7kbを挿入した。今回の検証では、より早期に作製できたChr.7 q arm に対する人工テロメア付加ベクターを用いて、ヒトiPS細胞内において染色体切断実験を実施した。結果、得られた薬剤耐性を示す24クローンを獲得できたため、PCR解析を行った。しかしながら、期待した相同組み換えや染色体切断結果を示すクローンは獲得できなかった。一方で、ヒト細胞から他のヒト細胞への染色体導入法の開発について検討した。微小核を形成しうる化合物として、コルセミド及び、MAS溶液について不死化間葉系幹細胞、ヒトiPS細胞に対して、微小核形成可能か評価した。不死化間葉系幹細胞については、コルセミド0.1µg/mL、ヒトiPS細胞については、MAS溶液0.1µg/mLを用いた際に、微小核形成が見られ、染色体導入を行ったところ、1x10-6程度の染色体導入効率が得られた。さらに、染色体導入効率を高めるために、高効率染色体導入法を適応するために必要なCD46 KO細胞を作製することを試みた。CD46 KO CRISPR/Cas9ベクターを作製した。これを不死化間葉系幹細胞に対して導入し、5~10%程度のCD46陰性細胞集団を取得した。
Current Status of Research Progress	Current Status of Research Progress 2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned. Reason ヒト染色体ベクターの構築については、当初計画から遅れている。想定された研究困難性であるため、代替法を早急に検討する必要がある。一方で、ヒト細胞からヒト細胞への染色体導入法の開発については、当初計画に対して1年ほど先行し、新規手法の開発を達成しつつある。総合的に評価し、概ね順調に進展していると判断した。
Strategy for Future Research Activity	今後について、代替のヒト人工染色体ベクター候補染色体とした、21番染色体よりヒト人工染色体ベクターの構築を試みる。まずは、Chr.21について、ヒト人工染色体ベクター構築のために切断可能なCRISPR/Cas9を作製する。また、相同組み換え配列をもつテロメア付加ベクターを作製する。また、ヒト細胞からヒト細胞への染色体導入法に関しては、CD46 KO細胞に対して、高効率染色体導入法を適応し、染色体導入効率が改善されるか検討する。