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ゲノム編集技術と一細胞RNA-seq解析を融合した機能的エンハンサー探索法の開発

Research Project

Project/Area Number 18K19636
Research Category

Grant-in-Aid for Challenging Research (Exploratory)

Allocation TypeMulti-year Fund
Review Section Medium-sized Section 57:Oral science and related fields
Research InstitutionThe University of Tokyo

Principal Investigator

北條 宏徳  東京大学, 大学院医学系研究科(医学部), 准教授 (80788422)

Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) 大庭 伸介  長崎大学, 医歯薬学総合研究科(歯学系), 教授 (20466733)
Project Period (FY) 2018-06-29 – 2021-03-31
Project Status Granted (Fiscal Year 2019)
Budget Amount *help
¥6,370,000 (Direct Cost: ¥4,900,000、Indirect Cost: ¥1,470,000)
Fiscal Year 2020: ¥2,470,000 (Direct Cost: ¥1,900,000、Indirect Cost: ¥570,000)
Fiscal Year 2019: ¥2,600,000 (Direct Cost: ¥2,000,000、Indirect Cost: ¥600,000)
Fiscal Year 2018: ¥1,300,000 (Direct Cost: ¥1,000,000、Indirect Cost: ¥300,000)
Keywordsエンハンサースクリーニング / ゲノム編集 / 骨形成 / エンハンサー / 転写制御 / 一細胞RNA-seq / 骨発生 / 一細胞解析
Outline of Annual Research Achievements

2019年度ではまず、これまでに得られたエンハンサー候補領域を標的とするガイドRNAウイルスライブラリーを作製した。ガイドRNA配列をsingle-cell RNA-seqプラットホームで解析可能なCROPseqベクターを用いた。当初、分子バーコードを有する別のウイルスベクターを使用予定であったが、文献に基づく検討の結果、CROPseqベクターを用いることとした。これにより、分子バーコードとガイドRNA配列の対応付けにかかる煩雑な実験と解析を回避することが可能になった。各エンハンサー候補に対するガイドRNA配列を有するベクターを構築後、これらを統合し、ウイルスパッケージング用ベクターおよび組み換え用ベクターと一緒に293T細胞に遺伝子導入し、レンチウイルスライブラリーを作製した。また、Cas9を恒常的に発現する骨芽細胞株を作製し、本レンチウイルスライブラリーを感染させた。CROPseqベクターにはピューロマイシン耐性遺伝子がコードされているため、ウイルス感染細胞をピューロマイシンにより選別後、リコンビナントヒトBone morphogenetic protein (rhBMP2)を一週間曝露し骨芽細胞の分化を誘導した。その後、酵素処理により細胞を単離後、一細胞ごとに10x Genomics社の Chromiumシステムによる一細胞バーコード(Droplet バーコード)付与を行った。一細胞RNA-seq解析により各Dropletバーコードに対する遺伝子発現プロファイルとgRNAプロファイルを得た。バイオインフォマティクスの手法を用いて、各細胞におけるGenotype(エンハンサー欠損部位)と、Phenotype(遺伝子発現プロファイル)を対応付けることで、どのエンハンサー候補群が、骨芽細胞の分化に寄与するか絞り込んだ。これにより、有望エンハンサーが同定された。

Current Status of Research Progress
Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

当初の予定通り進んでおり、有望なエンハンサー候補が得られているため

Strategy for Future Research Activity

当初の予定通り、研究を進める

Report

(2 results)
  • 2019 Research-status Report
  • 2018 Research-status Report

Research Products

(7 results)

All 2020 2019 2018

All Journal Article Presentation

  • [Journal Article] Stepwise strategy for generating osteoblasts from human pluripotent stem cells under fully defined xeno-free conditions with small-molecule inducers.2020

    • Author(s)
      Zujur Denise、Kanke Kosuke、Onodera Shoko、Tani Shoichiro、Lai Jenny、Azuma Toshifumi、Xin Xiaonan、Lichtler Alexander C.、Rowe David W.、Saito Taku、Tanaka Sakae、Masaki Hideki、Nakauchi Hiromitsu、Chung Ung-il、Hojo Hironori、Ohba Shinsuke
    • Journal Title

      Regen Ther

      Volume: 14 Pages: 19-31

    • DOI

      10.1016/j.reth.2019.12.010

    • Related Report
      2019 Research-status Report
    • Peer Reviewed / Open Access / Int'l Joint Research
  • [Journal Article] Insights into gene regulatory networks in chondrocytes.2019

    • Author(s)
      Hojo Hironori、Ohba Shinsuke
    • Journal Title

      Int J Mol Sci

      Volume: 20 Pages: 6324-6324

    • DOI

      10.3390/ijms20246324

    • Related Report
      2019 Research-status Report
    • Peer Reviewed / Open Access
  • [Journal Article] Simple and Robust Differentiation of Human Pluripotent Stem Cells toward Chondrocytes by Two Small-Molecule Compounds.2019

    • Author(s)
      Kawata Manabu、Mori Daisuke、Kanke Kosuke、Hojo Hironori、Ohba Shinsuke、Chung Ung-il、Yano Fumiko、Masaki Hideki、Otsu Makoto、Nakauchi Hiromitsu、Tanaka Sakae、Saito Taku
    • Journal Title

      Stem Cell Reports.

      Volume: 13 Pages: 530-544

    • DOI

      10.1016/j.stemcr.2019.07.012

    • Related Report
      2019 Research-status Report
    • Peer Reviewed / Open Access / Int'l Joint Research
  • [Journal Article] Generation of orthotopically functional salivary gland from embryonic stem cells.2018

    • Author(s)
      Tanaka Junichi、Ogawa Miho、Hojo Hironori、Kawashima Yusuke、Mabuchi Yo、Hata Kenji、Nakamura Shiro、Yasuhara Rika、Takamatsu Koki、Irie Tarou、Fukada Toshiyuki、Sakai Takayoshi、Inoue Tomio、Nishimura Riko、Ohara Osamu、Saito Ichiro、Ohba Shinsuke、Tsuji Takashi、Mishima Kenji
    • Journal Title

      Nat Commun

      Volume: 9 Pages: 1-13

    • DOI

      10.1038/s41467-018-06469-7

    • Related Report
      2018 Research-status Report
    • Peer Reviewed / Open Access / Int'l Joint Research
  • [Presentation] Cell-type-distinct regulatory action of Runx2 on the genome underlies its distinct roles in osteoblasts and chondrocytes.2019

    • Author(s)
      Hojo H, Ohba S, Yamakawa A, Guo Q, He X, Saito T, Onodera S, Azuma T, Chung UI, McMahon AP.
    • Organizer
      2019 Annual Meeting of the American Society for Bone and Mineral Research
    • Related Report
      2019 Research-status Report
    • Int'l Joint Research
  • [Presentation] Runx2は骨格発生において細胞種特異的な転写制御領域に作用する2019

    • Author(s)
      北條宏徳、山川晃、齋藤琢、小野寺晶子、東俊文、鄭雄一、大庭伸介
    • Organizer
      第37回日本骨代謝学会学術集会
    • Related Report
      2019 Research-status Report
  • [Presentation] A chondrocyte-specific Indian hedgehog enhancer as an OA-driving enhancer.2019

    • Author(s)
      Yamakawa A, Hojo H, Chung UI, Ohba S
    • Organizer
      Orthopedic Research Society 2018 Annual Meeting
    • Related Report
      2018 Research-status Report
    • Int'l Joint Research

URL: 

Published: 2018-07-25   Modified: 2021-01-27  

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