| Project/Area Number |
18KK0458
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| Research Category |
Fund for the Promotion of Joint International Research (Fostering Joint International Research (A))
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| Allocation Type | Multi-year Fund |
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| Research Field |
Basic / Social brain science
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| Research Institution | Niigata University |
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Principal Investigator |
阿部 学 新潟大学, 脳研究所, 准教授 (10334674)
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| Project Period (FY) |
2019 – 2024
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| Project Status |
Granted (Fiscal Year 2023)
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| Budget Amount *help |
¥15,600,000 (Direct Cost: ¥12,000,000、Indirect Cost: ¥3,600,000)
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| Keywords | 遺伝子改変ラット / ドーパミン / ゲノム編集 / コンディショナル遺伝子発現制御 |
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| Outline of Research at the Start |
遺伝子改変ラットを用いた青班核ノルアドレナリンニューロンからのドーパミンシグナル伝達機構及び新奇体験による記憶保持の強化の分子機構の解明を目的とする国際共同研究をデンマークAarhus大学DANDRITE研究所の竹内倫徳博士と共に計画した。基課題にて開発されたコンディショナル低分子タグ発現カセットを用いたドーパミン受容体、ドーパミン生合成酵素等を標的としたノックインラットを作製して標的タンパクの発現、動態解析と行動試験を竹内研究室で行い、基課題の研究の発展性を実証しつつ本課題の目的を達成する。また、記憶保持の強化過程の解析に有用なcFos-tTAノックインラット系統の解析も行う。
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| Outline of Annual Research Achievements |
コンディショナル遺伝子発現制御法（生体内における遺伝子発現時間、発現量、発現細胞種などに任意の制限を加える方法）は遺伝子機能の解析技術として極めて強力であるが、内在遺伝子に対しての点変異や低分子タグのノックイン（KI）など微細な変異への適用が困難であることや、変異動物作製のため長い実験期間を要することが問題であった。研究代表者は基課題において、Cre/loxP組換え系を用いた新規コンディショナル遺伝子発現制御法とゲノム編集技術と組み合わせることで、従来の点変異/低分子タグ等のノックイン法が内包する問題点を克服できる可能性を見出し、その検証のため、遺伝子改変マウスを用いた小脳発達の分子機構の解明を目的とした研究を行った。
基課題の研究を発展させ、遺伝子改変ラットを用いた青班核ノルアドレナリンニューロンからのドーパミンシグナル伝達機構及び新奇体験による記憶保持の強化の分子機構の解明を目的とする国際共同研究をデンマークAarhus大学DANDRITE研究所の竹内倫徳博士と共に計画した。基課題にて開発されたコンディショナル低分子タグ発現カセットを用いたドーパミン受容体、ドーパミン生合成酵素等を標的としたKIラットを作製して標的タンパクの発現、動態解析と行動試験を行う。個別目標としては（１）青班核軸索と海馬神経細胞における神経伝達物質とその受容体の関係性の解析（２）青班核ニューロンからのドーパミン放出の分子機序の解析（３）記憶保持の強化過程における海馬ドーパミン受容体の機能解析を設定した。また、記憶保持の強化過程の解析に有用なcFos-tTA KI、Thy1-ChR2 KI、tTAの動作検証のためのtetO-H2B tdTomato KI、記憶保持と遺伝子発現の関係を明らかにするための低分子タグKI（コンディショナルRpl22-HA KI）など各種のラット系統の作製と解析も行う。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
4: Progress in research has been delayed.
Reason
今年度も各種実験の補助とラット飼育管理等のために実験補助員1名を昨年度より引き続き雇用し、ゲノム編集法によるKIラット作製および繁殖と解析を国内にて研究協力者および実験補助員と共に行った。作製したラットについてはDANDRITE研究所へ導入し、個別目標の達成を目指す予定である。
cFos-tTA KIラットについては本課題で新規に開発したゲノム編集技術のAAV-GONAD法（Abe et al., Sci Rep 2023）により再度の作製を試みたが現時点で系統樹立には至っていない。樹立済みのtetO-H2B tdTomato KI系統の繁殖は順調であり、cFos-tTA KI系統が作製できしだい交配できるようコロニーを維持している。コンディショナルRpl22-HA KI系統も作製を継続中である。また、ドーパミンシグナル伝達の制御に有用と考えられるThy1-ChR2 KI系統（神経細胞選択的チャネルロドプシン発現ラット）についても入手し繁殖と発現解析を開始した。
代表者と海外共同研究者は定期的に研究進行状況について打ち合わせ、順調に結果が得られつつあるという認識で一致しており、本課題にも関連する成果として、記憶学習に重要な役割を果たすNMDA型グルタミン酸受容体サブユニットのマウス脳内における発現タンパク定量の結果を共著論文として発表することができた（Suzuki et al., Neurochem Int 2023）。しかし代表者自身が渡航し、ノックイン遺伝子の発現検証、低分子タグ付加タンパクの動態解析、薬剤によるドーパミンシグナル伝達の制御可能なKIラットの行動試験を行うという本課題の主要な目的については、令和5年度末時点でも実現できていない。（現在、令和6年度中の渡航計画を海外共同研究者と調整中である。）
上記の理由で、進捗状況に関しては「遅れている」と評価した。
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| Strategy for Future Research Activity |
研究代表者は、海外共同研究者の研究室において（1）2つの異なるドーパミン依存的な新奇性回路による日常の記憶の亢進、（2）絶対的新奇性による日常の記憶の亢進に関与するタンパク質の同定、（3）ドーパミン依存的な新たな情報の知識への統合を明らかにするための研究に参画し、代表者が技術的見地より個別の導入遺伝子変異について合議し、分子生物学、生化学、解剖学的実験を含んだ研究を遂行する予定である 。
しかし新型コロナウイルス感染症流行のため代表者と海外共同研究者の長期研究計画が大幅に乱れ日程調整が困難であったことから令和5年度の渡航については見合わせ、雇用中の実験補助員とともに国内で実施可能な研究を継続した。今後は、cFos-tTA KI系統を作製し、そのtTA活性についてはtetO-H2B tdTomato KI系統を用いて脳組織透明化による全脳イメージングで評価する予定である。なお、H2B-tdTomatoの発現誘導についてはKIラット由来初代線維芽細胞を用い検証済みである。コンディショナルRpl22-HA KI系統については部分的に変異遺伝子の挿入された個体の作出には成功していたが、改めて遺伝子導入条件を精査し完全な変異ラットを作製する。Thy1-ChR2 KI系統についてはノックイン遺伝子の発現解析中であるが、発現量が不十分である場合はそれを改善すべく遺伝子の部分改変を試みる。これらの系統について可能な限りその動作確認を行い、代表者の渡航前に海外共同研究者へ搬送する。（搬送動物の微生物的統御がなされている保証がある場合は動物個体の搬送が可能であることは確認済みである。）
現在（令和6年5月時点）は出入国の制限が解除されており、大幅に計画が遅れたが令和6年度中に渡航し本研究課題の達成を目指す。渡航時には研究代表者の国内での業務を果たすための代替要員を雇用する予定である。
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