ホモFRETによる複数機能の可視化技術開発

• Project/Area Number: 19021002
• Research Category: Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
• Allocation Type: Single-year Grants
• Review Section: Science and Engineering
• Research Institution: Hokkaido University
• Principal Investigator: 永井 健治 Hokkaido University, 電子科学研究所, 教授 (20311350)
• Project Period (FY): 2007 – 2008
• Project Status: Completed (Fiscal Year 2008)
• Budget Amount: ¥4,500,000 (Direct Cost: ¥4,500,000); Fiscal Year 2008: ¥2,300,000 (Direct Cost: ¥2,300,000); Fiscal Year 2007: ¥2,200,000 (Direct Cost: ¥2,200,000)
• Keywords: イメージング / FRET / 顕微鏡 / 可視化

Research Abstract

生体分子の機能を可視化するために波長の異なる2つの蛍光分子間で起こるFRET(ヘテロFRET)を利用した様々なプローブが近年開発されている。これらのFRETプローブは観察するための波長が広域であるため、他の蛍光プローブと同時に可視化することが難しい。そこで同一蛍光色分子間で生じるホモFRETを原理とするカルシウムセンサーW-cameleonを作成し、Ca^<2+>の有無での蛍光異方性を測定することが本研究の柱の1つである。今年度は昨年度作成したW-cameleonに様々な変異を導入することでダイナミックレンジの拡大化を行った。その結果、Ca^<2+>センサードメインであるCalmodulin内に蛍光タンパク質を挿入することで、より大きなダイナミックレンジを有するプローブを得ることに成功した。
次に、作成したホモFRETプローブの蛍光異方性変化を顕微鏡下で高感度に観察するために、昨年度までに構築した蛍光偏光顕微鏡に改良を加えた。具体的には一片が5μm程度のフォトニック結晶製波長板と偏光板を組み合わせて、マルチアレー化した偏光解消補償板を開発し、対物レンズの後側焦点面に導入することで、高い消光比を得ることに成功した。これにより、対物レンズによる入射光の偏光解消が緩和され、僅かな蛍光異方性変化をも顕微鏡下で捉えることが可能になった。

Research Products

• [Journal Article] An ultramarine fluorescent protein with increased photostability and pH insensitivity (2009)
  • Author(s): Tomosugi W., Matsuda T, Tani T, Nemoto T, Kotera I, Saito K, Horikawa K, Nagai T
  • Journal Title: Nature Methods (印刷中)
  • NAID: 120001648573
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Two-photon excitation behavior of thiophene-based oligomeres and a polymer. n press, 2008 (2009)
  • Author(s): Yamamoto T, Kumagai A, Saito K & Nagai T.
  • Journal Title: Journal of Nanoscience and Nanotechnology 9 Pages: 670-672
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] 光スイッチング蛍光タンパク質を用いた超解像観察法 (2009)
  • Author(s): 永井健治
  • Journal Title: 分光研究 58 Pages: 7-9
  • NAID: 10024730583
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] 蛍光プローブ開発秘話-Pericam- (2009)
  • Author(s): 永井健治
  • Journal Title: 蛋白質核酸酵素 54 Pages: 86-92
• [Journal Article] A mercury arc lamp-based multi-color confocal real time imaging system for cellular structure and function (2008)
  • Author(s): Saito K, Kobayashi K, Tani T, Nagai T
  • Journal Title: Cell Structure Function 33 Pages: 133-141
  • NAID: 130004137533
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] A high-throughput and single-tube recombination of crude PCR products using a DNA polymerase inhibitor and type IIS restriction enzyme. 137 : 1-7, 2008 (2008)
  • Author(s): Kotera I, Nagai T
  • Journal Title: Journal of Biotechnology 137 Pages: 1-7
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Cell-cycle-specific nestin expression coordinates with morphological changes in embryonic cortical neural progenitors. 121 : 1204-1212, 2008 (2008)
  • Author(s): Sunabori T, Tokunaga A, Nagai T, Sawamoto K, Okabe M, Miyawaki A, Matsuzaki Y, Mivata T & Okano H.
  • Journal Title: Journal of Cell Sciince 121 Pages: 1204-1212
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] 光変換蛍光タンパク質を用いた生体分子の動態解析法 (2008)
  • Author(s): 永井健治、松田知己
  • Journal Title: 実験医学 26 Pages: 156-162
• [Journal Article] 新規の光変換蛍光蛋白質プローブを用いた生体イメージングと動態解析 (2008)
  • Author(s): 松田知己、永井健治
  • Journal Title: 蛋白質核酸酵素 53 Pages: 1858-1864
  • NAID: 40016306372
• [Journal Article] 光活性化・光変換蛍光タンパク質を用いたタンパク質動態解析 (2008)
  • Author(s): 松田知己、永井健治
  • Journal Title: バイオインダストリー 25 Pages: 21-26
• [Journal Article] Direct measurement of protein dynamics inside cells using a rationally designed photoconvertible protein. (2008)
  • Author(s): Matsuda T, Miyawaki A and Nagai T
  • Journal Title: Nature Methods 5 Pages: 339-345
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Cell-cycle-specific nestin expression coordinates with morpholo-gical changes in embryonic cortical neural progenitors. (2008)
  • Author(s): Sunabori T, Tokunaga A, Nagai T, Sawamoto K, Okabe M, Miyawaki A, Matsuzaki Y, Miyata T and Okano H
  • Journal Title: J. Cell Sci. 121 Pages: 1204-1212
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Local initiation of caspase activation in Drosophila salivary gl-and programmed cell death in vivo (2007)
  • Author(s): Takemoto K, Kuranaga E, Tonoki A, Nagai T, Miyawaki A, Miura M
  • Journal Title: Proc. Natl. Acad. Sci. USA 104 Pages: 13367-13372
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] New advances in nanomedicine: diagnosis and preventive med-icine. (2007)
  • Author(s): Wei C, Nagai T, Wei W, Nemoto T, Awais M, Niwa O, Kurita R and Baba Y
  • Journal Title: Med Clin North Am. 91 Pages: 871-879
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] 蛍光イメージング-最近の進歩:回折限界の壁を越える工夫- (2007)
  • Author(s): 永井 健治
  • Journal Title: 病理と臨床 25 Pages: 514-519
• [Journal Article] 大口径ファイバー白色光源を用いた高速共焦点顕微鏡の開発と評価 (2007)
  • Author(s): 齊藤健太、谷知己、小林健太郎、永井健治
  • Journal Title: 顕微鏡 42 Pages: 161-165
  • NAID: 10020010112
  • Peer Reviewed
• [Presentation] 改変蛍光タンパク質を利用した生理機能の可視化 (2009)
  • Author(s): 永井健治
  • Organizer: 日本学術振興会「未踏・ナノデバイステクノロジー」第151委員会研究会「ナノ計測の先端共用施設利用とナノ時空研究の一側面」
  • Place of Presentation: 物質・材料研究機構、つくば
  • Year and Date: 2009-01-31
• [Presentation] GFPを巧妙に用いた分子機能・動態の可視化 (2009)
  • Author(s): 永井健治
  • Organizer: 京都府立医科大学研究開発センター第8回学術講演会
  • Place of Presentation: 京都府立医科大学、京都
  • Year and Date: 2009-01-21
• [Presentation] Deciphering enigma of biological function by a genetically-encoded molecular spy (2009)
  • Author(s): Takeharu Nagai
  • Organizer: The 4^<th> LSW symposium
  • Place of Presentation: 北海道大学
  • Year and Date: 2009-01-09
• [Presentation] Engineering fluorescent proteins to visualize and manipulate biological functions (2008)
  • Author(s): Takeharu Nagai
  • Organizer: The 11^<th> Japan and America Frontier of Science
  • Place of Presentation: Beckman center, Irvine, USA
  • Year and Date: 2008-12-05
• [Presentation] Engineering fluorescent proteins to visualize biological functions (2008)
  • Author(s): Takeharu Nagai
  • Organizer: The 8^<th> Japan and America Frontier of Engineering
  • Place of Presentation: Kobe convention center, Kobe
  • Year and Date: 2008-11-17
• [Presentation] 蛍光タンパク質を巧妙に用いた分子機能・動態の可視化 (2008)
  • Author(s): 永井健治
  • Organizer: 日本薬学会関東支部第33回学術講演会
  • Place of Presentation: 長井記念館、東京
  • Year and Date: 2008-11-01
• [Presentation] Imagaing biological functions by using FRET-based sensor proteins (2008)
  • Author(s): Takeharu Nagai
  • Organizer: ICCB2008
  • Place of Presentation: COEX, Seoul, Korea
  • Year and Date: 2008-10-10
• [Presentation] Engineering fluorescent and bioluminescent proteins to visualize biological functions (2008)
  • Author(s): Takeharu Nagai
  • Organizer: NEWroscience2008
  • Place of Presentation: de Sao Paulo university, Brazil
  • Year and Date: 2008-09-08
• [Presentation] Engineering fluorescent and bioluminescent proteins to visualize biological functions (2008)
  • Author(s): Takeharu Nagai
  • Organizer: IBRO (I Neurolatam)
  • Place of Presentation: Buzios, Brazil
  • Year and Date: 2008-09-03
• [Presentation] 改変蛍光タンパク質によるタンパク質機能・動態のリアルタイム可視化 (2008)
  • Author(s): 永井健治
  • Organizer: 岩手医科大学先端医療研究センター公開シンポジウム「バイオイメージングと分子生物学による脳・血管解明一健康増進に向けた最先端研究」
  • Place of Presentation: 岩手県医師会館ホール、盛岡
  • Year and Date: 2008-07-19
• [Presentation] Direct measurement of protein dynamics in single living cells using a rationally designed photoconvertible fluorescent protein (2008)
  • Author(s): 永井健治
  • Organizer: 第60回日本細胞生物学会大会
  • Place of Presentation: パシフィコ横浜、横浜
  • Year and Date: 2008-06-29
• [Presentation] Direct measurement of protein dynamics in living cells using a rationally designed photoconvertible fluorescent protein (2008)
  • Author(s): Takeharu Nagai
  • Organizer: NIPS-JST international workshop
  • Place of Presentation: Okazaki conference center, Okazaki
  • Year and Date: 2008-04-18
• [Presentation] Development of a fluorescent protein with deep blue color (2008)
  • Author(s): Takeharu Nagai
  • Organizer: FOM2008
  • Place of Presentation: Awaji Yume Butai, Osaka
  • Year and Date: 2008-04-14
• [Presentation] 群青色蛍光蛋白質の開発 (2007)
  • Author(s): 友杉亘、松田知己、小寺一平、齊藤健太、永井健治
  • Organizer: 日本生物物理学会第45回年会
  • Place of Presentation: パシフィコ横浜
  • Year and Date: 2007-12-21
• [Presentation] Imaging Biological Events Using FRET-based Sensor Proteins (2007)
  • Author(s): Takeharu Nagai
  • Organizer: International Symposium on Advance Tech-niques for Molecular Imaging
  • Place of Presentation: Taichun, Taiwan
  • Year and Date: 2007-12-15
• [Presentation] 合理的に設計した光変換蛍光タンパク質による生きた細胞内のタンパク質動態解析 (2007)
  • Author(s): 永井健治
  • Organizer: 第32回光学会
  • Place of Presentation: 大阪大学
  • Year and Date: 2007-11-28
• [Presentation] Engineering fluorescent and bioluminescent proteins to visuali-ze biological functions (2007)
  • Author(s): Takeharu Nagai
  • Organizer: The 19th KAMCB
  • Place of Presentation: Seoul, Korea
  • Year and Date: 2007-10-19
• [Presentation] Engineering fluorescent and bioluminescent proteins to visuali-ze biological functions (2007)
  • Author(s): Takeharu Nagai
  • Organizer: 5th international forum on post-genome tec-hnologies
  • Place of Presentation: Suzhou, China
  • Year and Date: 2007-09-09
• [Presentation] Engineering fluorescent and bioluminescent proteins to visuali-ze biological functions (2007)
  • Author(s): Takeharu Nagai
  • Organizer: The 2nd International Workshop on Appro-aches to Single-Cell Analysis
  • Place of Presentation: Waseda Univ, Tokyo
  • Year and Date: 2007-09-06
• [Presentation] Visualization of biological function by using FRET- and BRET-based indicator (2007)
  • Author(s): Takeharu Nagai
  • Organizer: The 3rd Asian and Pacific Rim Symposiu-m on Biophotonics & Biophotonics
  • Place of Presentation: Cairns, Australia
  • Year and Date: 2007-07-09
• [Presentation] 蛍光・化学発光タンパク質を利用して何ができるか? (2007)
  • Author(s): 永井健治
  • Organizer: 生物発光化学発光研究会第25回学術講演会
  • Place of Presentation: 北海道大学
  • Year and Date: 2007-06-30
• [Presentation] Various Applications of Fluorescent Proteins for Cell Biollog-y (2007)
  • Author(s): Takeharu Nagai
  • Organizer: 16th Annual Meeting of the Korean Societ-y for Smooth Muscle Research
  • Place of Presentation: Seoul, Korea
  • Year and Date: 2007-06-16
• [Book] 改変型蛍光タンパク質の利用 (2007)
  • Author(s): 永井健治
  • Total Pages: 12
  • Publisher: 講義と実習 生細胞蛍光イメージング 原口徳子、木村宏、平岡泰編集(分担執筆)共立出版
• [Book] 共鳴エネルギー移動(FRET)の基礎 (2007)
  • Author(s): 永井健治、小寺一平
  • Total Pages: 8
  • Publisher: 講義と実習 生細胞蛍光イメージング 原口徳子、木村宏、平岡泰編集(分担執筆)共立出版
• [Book] FRETの測定と評価 (2007)
  • Author(s): 永井健治、齊藤健太
  • Total Pages: 11
  • Publisher: 講義と実習 生細胞蛍光イメージング 原口徳子、木村宏、平岡泰編集(分担執筆)共立出版
• [Book] 実習 FRET (2007)
  • Author(s): 齊藤健太、松田知己、原口徳子、永井健治
  • Total Pages: 10
  • Publisher: 講義と実習 生細胞蛍光イメージング 原口徳子、木村宏、平岡泰編集(分担執筆)、共立出版
• [Book] 実習 全反射顕微鏡 (2007)
  • Author(s): 小寺一平、谷知己、永井健治
  • Total Pages: 7
  • Publisher: 講義と実習 生細胞蛍光イメージング 原口徳子、木村宏、平岡泰編集(分担執筆)、共立出版
• [Book] アポトーシスの検出 (2007)
  • Author(s): 竹本研、永井健治、宮脇敦史、三浦正幸
  • Total Pages: 4
  • Publisher: 実験がうまくいく 蛍光・発光試薬の選び方と使い方 三輪佳宏編集(分担執筆)、羊土社
• [Book] スパイは一人で充分 (2007)
  • Author(s): 谷知己、永井健治
  • Total Pages: 1
  • Publisher: 実験がうまくいく 蛍光・発光試薬の選び方と使い方 三輪佳宏編集(分担執筆)、羊土社
• [Book] FRETプローブ (2007)
  • Author(s): 小寺一平、永井健治
  • Total Pages: 5
  • Publisher: 実験がうまくいく 蛍光・発光試薬の選び方と使い方 三輪佳宏編集(分担執筆)、羊土社
• [Book] 発光性蛋白質を利用したバイオセンサーの開発 (2007)
  • Author(s): 永井健治
  • Total Pages: 17
  • Publisher: バイオとナノの融合I新生命科学の基礎、北海道大学COE研究成果編集委員会(分担執筆)、北海道大学
• [Remarks]
  • URL: http://nano.es.hokudai.ac.jp/
• [Remarks]
  • URL: http://nano.es.hokudai.ac.jp/
• [Patent(Industrial Property Rights)] 組み換えDNAの調整法 (2007)
  • Inventor(s): 永井健治、小寺一平
  • Industrial Property Rights Holder: 北海道大学
  • Industrial Property Number: 2007-215238
  • Filing Date: 2007-08-21
• [Patent(Industrial Property Rights)] 群青色蛍光タンパク質 (2007)
  • Inventor(s): 永井健治、友杉亘 松田知己
  • Industrial Property Rights Holder: 北海道大学
  • Industrial Property Number: 2007-203300
  • Filing Date: 2007-08-03