1分子シーケンスに資する化学修飾DNA断片および核酸基質アナログの創製

• Project/Area Number: 19021008
• Research Category: Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
• Allocation Type: Single-year Grants
• Review Section: Science and Engineering
• Research Institution: Gunma University
• Principal Investigator: 桑原 正靖 Gunma University, 大学院・工学研究科, 助教 (40334130)
• Project Period (FY): 2007 – 2008
• Project Status: Completed (Fiscal Year 2008)
• Budget Amount: ¥5,200,000 (Direct Cost: ¥5,200,000); Fiscal Year 2008: ¥2,600,000 (Direct Cost: ¥2,600,000); Fiscal Year 2007: ¥2,600,000 (Direct Cost: ¥2,600,000)
• Keywords: 核酸 / 有機化学 / バイオテクノロジー / 生体生命情報学

Research Abstract

パイロシーケンシング法は、高速でハイスループットな遺伝子解析を可能にした核酸塩基配列決定法であり、現在、装置の小型化や低価格化などが進められている。しかし、鎖伸長反応に用いられるdATPもATPと同様にルシフェラーゼの基質として作用するため、dATPがルシフェラーゼ反応に干渉することが問題となる。これを避けるために、dATPの代わりに、dATPαSおよびその誘導体が用いられているが、鎖伸長反応で生成するS-オリゴによるポリメラーゼ反応の効率低下などが考えられるため、未だ改良の余地を残している。本研究において新たに核酸基質アナログを合成し、パイロシーケンシングに於けるそれらの評価を行ったところ、そのうちのひとつのアナログはdATPを用いた場合に比べて、バックグラウンドシグナルを33倍ほど低減させることが分かった。これは、このアナログはポリメラーゼの良い基質として働く一方で、フェラーゼに対する基質特性が乏しいことを示唆している。次に、シーケンシングに用いる鋳型DNAの簡便な固定法を検討した。ビオチンとアクリドンを直列に連結させた基質アナログ(TTP^<ACR-Bio>)を新たに合成し、末端デオキシヌクレオチジル転移酵素(TdT)に対する基質特性を試みたところ、DNA断片の3'末端に1~3残基導入されることが分かった。さらに、それらが2ないし3残基導入されたDNA断片は効率よくアビジンにトラップされ、固定化できることが確認された。修飾DNAの酵素的作製法は、このような新しい修飾基質アナログの開発に加え、関連する酵素の改変により、パイロシーケンシング法の大幅な改良や新しい核酸塩基配列決定法への応用が期待される。

Research Products

• [Journal Article] Systematic analysis of enzymatic DNA polymerization using oligo-DNA templates and triphosphate analogs involving 2',4'-bridged nucleosides (2008)
  • Author(s): M. Kuwahara, S. Obika, J. Nagashima, Y. Ohta, Y. Suto, H. Ozaki, H. Sawai, and T. Imanishi
  • Journal Title: Nucleic Acids Res. 36, (13) Pages: 4257-4265
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Acridone-tagged DNA as a new probe for DNA detection by fluorescence resonarce energy transfer and for mismatch DNA recognition (2008)
  • Author(s): Y. Hagiwara, T. Hasegawa, A. Shoji, M Kuwahara Ozaki H. and Sawai
  • Journal Title: Bioorg. Med. Chem. 16, (14) Pages: 7013-7020
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Effect of backbone-modification of oligodeoxyribonucleic acid on primer extension reactions (2008)
  • Author(s): M. Kuwahara, S. Minezaki, J. Nagashima. H. Ozaki. h. Sawai.
  • Journal Title: Nucleic Acids Symp. Ser. 52 Pages: 453-454
• [Journal Article] Arginine-modified DNA Aptamers That Show Enantioselective Recognition of the Dicarboxylic Acid Moiety of Glutamic Acid (2008)
  • Author(s): Kazuomi Ohsawa, Toshiyuki Kasamatsu, Jun-ichi Nagashima, Kazuo Hanawa, Masayasu Kuwahara, Hiroaki Ozaki and Hiroaki Sawai
  • Journal Title: Analytical Sciences 24,(1) Pages: 167-172
  • NAID: 10020143849
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] A modified DNA aptamer that binds the (R)-isomer of a thalidomide derivative with high enantioselectivity. (2007)
  • Author(s): Atsushi Shoji, Masayasu Kuwahara, Hiroaki Ozaki and Hiroaki Sawai
  • Journal Title: Journal of the American Chemical Society 129,(5) Pages: 1456-1464
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Polymerisation of a DNA strand using oligo-DNA template with modified bases, sugars and phosphates (2007)
  • Author(s): Jun-ichi Nagashima, Satoshi Minezaki, Satoshi Obika, Takeshi Imanishi, Masayasu Kuwahara and Hiroaki Sawai
  • Journal Title: Nucleic Acids Symposium Series 51 Pages: 55-56
• [Presentation] DNA鎖の主鎖修飾がポリメラーゼ反応に及ぼす影響 (2009)
  • Author(s): 桑原正靖, 竹島英俊, 峯崎賢巳, 太田裕貴, 尾崎広明, 澤井宏明
  • Organizer: 第3回バイオ関連化学合同シンポジウム
  • Place of Presentation: 神奈川
  • Year and Date: 2009-09-18
• [Presentation] DNA二重鎖中におけるアクリドニル基の塩基認識 (2009)
  • Author(s): 桑原正靖, 田島正義, 尾崎広明
  • Organizer: 日本化学会第89春季年会
  • Place of Presentation: 千葉
  • Year and Date: 2009-03-27
• [Presentation] 2', 4'-架橋型ヌクレオシドの酵素的DNA末端標識とヌクレアーゼ耐性の評価 (2009)
  • Author(s): 萩原慶彦, 竹島英俊, 桑原正靖, 尾崎広明, 澤井宏明, 小比賀聡, 今西武
  • Organizer: 日本化学会第89春季年会
  • Place of Presentation: 千葉
  • Year and Date: 2009-03-27
• [Presentation] 人工核酸アプタマー〜生命計測や医薬・診断薬への応用を目指して~ (2008)
  • Author(s): 桑原正靖
  • Organizer: 日本化学会生命化学研究会
  • Place of Presentation: 群馬
  • Year and Date: 2008-11-29
• [Presentation] 末端デオキシヌクレオチド転移酵素に対する2', 4'-架橋型ヌクレオシド三リン酸の基質特性の評価 (2008)
  • Author(s): 竹島英俊, 桑原正靖, 小比賀聡, 尾崎広明, 澤井宏明, 今西武
  • Organizer: 日本化学会第2回関東支部大会
  • Place of Presentation: 群馬
  • Year and Date: 2008-09-18
• [Presentation] 主鎖骨格修飾ヌクレオチドを含むDNA鋳型鎖を用いたポリメラーゼ反応 (2008)
  • Author(s): 永島潤一・峯崎賢巳・桑原正靖・尾崎広明・澤井宏明
  • Organizer: 日本化学会 第88回春季年会
  • Place of Presentation: 東京
  • Year and Date: 2008-03-28
• [Presentation] DNAの二次構造を認識する修飾DNAアプタマーの最小化とその機能評価 (2008)
  • Author(s): 桑原正靖・森角裕平・笠松敏幸・尾崎広明・澤井宏明
  • Organizer: 日本化学会 第88回春季年会
  • Place of Presentation: 東京
  • Year and Date: 2008-03-28
• [Presentation] DNAポリメラーゼによる主鎖骨格修鋳型鎖の配列読取り (2007)
  • Author(s): 峯崎賢巳, 永島潤一, 桑原正靖, 尾崎広明, 澤井宏明
  • Organizer: 第22回生体機能関連化学シンポジウム
  • Place of Presentation: 仙台
  • Year and Date: 2007-09-29
• [Presentation] Synthesis of acridonyl-dUTP analog and its substrate property during a polymerase reaction (2007)
  • Author(s): Masayasu Kuwahara, Jun-ichi Nagashima, Hidetoshi Takeshima, Hiroaki Ozaki and Hiroaki Sawai
  • Organizer: The 2nd international workshop on approaches to single-cellanalysis
  • Place of Presentation: 東京
  • Year and Date: 2007-09-07
• [Patent(Industrial Property Rights)] 新規ヌクレオシド誘導体、それを含むポリヌクレオチド及びそれを用いた塩基の識別方法 (2009)
  • Inventor(s): 桑原正靖・尾崎広明
  • Industrial Property Rights Holder: 群馬大学
  • Industrial Property Number: 2009-072157
  • Filing Date: 2009-03-24