| Project/Area Number |
19021017
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| Research Category |
Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
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| Allocation Type | Single-year Grants |
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| Review Section |
Science and Engineering
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| Research Institution | Kobe University |
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Principal Investigator |
荻野 千秋 Kobe University, 工学研究科, 准教授 (00313693)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
清水 宣明 金沢大学, 自然計測応用研究センター, 教授 (50019634)
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| Project Period (FY) |
2007 – 2008
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| Project Status |
Completed (Fiscal Year 2008)
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| Budget Amount *help |
¥5,000,000 (Direct Cost: ¥5,000,000)
Fiscal Year 2008: ¥2,500,000 (Direct Cost: ¥2,500,000)
Fiscal Year 2007: ¥2,500,000 (Direct Cost: ¥2,500,000)
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| Keywords | DNAアプタマー / アミノ酸 / 原子間力顕微鏡 / 80H-dG |
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| Research Abstract |
【緒言】従来、DNAアプタマーを得るためには、試験管内で、ランダム配列を持つDNA群から親和性クロマトグラフィーの原理を用いて選抜するSELEX法という手法が用いられている。しかし、この手法では、標的分子と、得られたアプタマーの結合力、及び結合特異性を操作することは難しい。そこで我々は、原子間力顕微鏡(AFM)を用いた、DNAアプタマーの新規SELEX法を提案した。
【実験方法】60塩基のランダム配列を持つDNA群を、ビオチン化プライマーを用いたPCRによりビオチン化した。金板にアビジンを固定化した後、ビオチン-アビジン結合を介して一本鎖DNA群を固定化した。本研究で標的分子としているアミノ酸のL-ロイシンをカンチレバーに固定化する。L-メチオニンを含むBinding buffer中で一本鎖DNAを固定化した金板上を走査する。このとき、一本鎖DNAとL-ロイシンとの間で結合が起こり、さらにこの結合力がビオチン-アビジン結合の結合力を上回れば、ビオチン-アビジン結合が切断され、カンチレバー上に一本鎖DNAが残る。この一本鎖DNAを溶出し、PCRにより増幅する。これらの操作を1回の選抜ラウンドとし、これを繰り返すことにより、L-ロイシンに高い特異性と結合力を有するアプタマーを選抜した。
【結果と考察】セレクションのラウンド3まで行った結果、ラウンドを進めるのに従って、それぞれラウンドのL-ロイシンと一本鎖DNA間の平均結合力が増加していった。このことから、L-ロイシンに対してのアプタマーが選抜されていると考えられる。また、得られたアプタマーの配列および、二次構造を解析したところ、構造中にアプタマー内の構造として代表的なループ構造を有していることが確認された。
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