| Project/Area Number |
19021045
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| Research Category |
Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
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| Allocation Type | Single-year Grants |
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| Review Section |
Science and Engineering
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| Research Institution | Soka University |
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Principal Investigator |
久保 いづみ Soka University, 工学部, 教授 (40214986)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
永井 秀典 産業技術総合研究所, ヒューマンストレスシグナル研究センター, 研究員 (40357596)
高瀬 明 創価大学, 工学部, 教授 (60236221)
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| Project Period (FY) |
2007 – 2008
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| Project Status |
Completed (Fiscal Year 2008)
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| Budget Amount *help |
¥3,500,000 (Direct Cost: ¥3,500,000)
Fiscal Year 2008: ¥1,100,000 (Direct Cost: ¥1,100,000)
Fiscal Year 2007: ¥2,400,000 (Direct Cost: ¥2,400,000)
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| Keywords | ハイスループット / 単一細胞分離 / アッセイ / サルモネラ / PCR / ラボCD / ナノリットル / invA遺伝子 / Lab-CD / 遠心力 / 細胞培養 / Jurkat Cell / マウス胎児性線維芽細胞 / 酵母 |
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| Research Abstract |
ラボCDはマイクロ流路をシリコン基板に反応性イオンエッチング(Deep-RIE)により形成させて作製した。流路はディスクの中心から外側に向けてジグザグ形に作成した。一枚のディスク上に24本の流路があり、一本の流路に313個のμチャンバーが付いている。チャンバーのサイズは300μm×200μm×46μmのU字型である。チャンバー一つあたりに分離される溶液の体積は約1.5nlである。このラボCDのインレット部分にPCR試薬とサルモネラ菌の混合溶液を1μl入れ、5000rpmで30秒間回転させる事によって細胞単離を行った。その後、連続的にthermal cyclerを用いて95℃で2分の溶菌、続けて95℃で5秒、55℃で10秒、72℃で10秒のサイクルで反応させる事によってPCRを行い、サルモネラ菌固有遺伝子であるinvA遺伝子を増幅し、イメージングアナライザーで蛍光強度を確認した。
細胞一個からのPCRが可能か調べるために、PCR試薬中に400cells/μlの濃度でサルモネラ菌を入れ、細胞単離を行った後、溶菌し、PCRを行い、その蛍光強度を確認してみた。その結果、ボアソン分布に依存した細胞数に従った蛍光強度の分布を確認する事ができた。Table1には、それぞれの濃度でのボアソン分布による各μチャンバーに入る細胞の数の確率を示した。このことから、細胞数に応じた蛍光強度になる事が確認された。また、今後の研究においては蛍光強度が2500を越えたものをポジティブとすることに決めた。
さらに、大腸菌とサルモネラ菌を100cells/μlの濃度でPCR試薬中に入れたものでもPCRを行った。その結果、200cells/μlのサルモネラ菌のみを入れたPCR試薬の結果よりも、少ない細胞数が確認された。200cells/μlの大腸菌のみを入れたものでは全く蛍光強度が上がらなかったため、大腸菌とサルモネラ菌との間でサルモネラ菌に対しての選択性が確認された。
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