構造変化感受性蛍光タンパク質を用いたTrk受容体リン酸化のライブイメージング

• Project/Area Number: 19037001
• Research Category: Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
• Allocation Type: Single-year Grants
• Review Section: Biological Sciences
• Research Institution: Hokkaido University
• Principal Investigator: 谷 知己 Hokkaido University, 電子科学研究所, 准教授 (80332378)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 永井 健治 北海道大学, 電子科学研究所, 教授 (20311350)
• Project Period (FY): 2007 – 2008
• Project Status: Completed (Fiscal Year 2008)
• Budget Amount: ¥4,500,000 (Direct Cost: ¥4,500,000); Fiscal Year 2008: ¥1,900,000 (Direct Cost: ¥1,900,000); Fiscal Year 2007: ¥2,600,000 (Direct Cost: ¥2,600,000)
• Keywords: ライブイメージング / 蛍光顕微鏡 / 蛍光タンパク質 / 神経栄養因子 / チロシンキナーゼ型受容体 / 蛍光観察 / GFPテクノロジー / タンパク質構造変化 / 神経軸索伸長

Research Abstract

膜タンパク質TrkAは広く神経細胞に発現し、代表的な神経栄養因子である神経成長因子NGFの受容体として、脳神経発生の制御に不可欠のタンパク質である。NGFの結合に伴うこのタンパク質の活性化を可視化する目的で、構造変化依存的に蛍光強度を変化する円順列変異蛍光タンパク質を、構造解析から予想されるTrkA受容体の活性化依存的な構造変化部位5カ所に挿入した変異遺伝子を作成し、この遺伝子を発現させたHeLa細胞およびPC12細胞を蛍光顕微鏡で観察した。作成した遺伝子のうち、HeLa細胞膜に発現したものは、受容体C末端近傍のkpnI切断部位とC末端に蛍光タンパク質を導入したもののみであったので、これらの部位にさまざまな蛍光タンパク質変異体遺伝子を導入した遺伝子を構築し、これらの遺伝子を発現したHeLa細胞およびPC12細胞に蛍光標識NGFを投与し、細胞表面へのNGF結合量と強制発現したTrkA-GFPの発現量との相関を調べた。不思議なことに、NGF結合とTrkA-GFPの発現量の相関は、HeLa細胞とPC12細胞で得られた結果が異なり、TrkA-GFPの発現量に対して結合したNGF量をプロットした回帰直線の傾きは、PC12細胞で得られたものが、HeLa細胞で得られたもののおよそ10倍となった。このことは、HeLa細胞で発現したTrkA-GFPは、NGF結合能が低下している事を示している。PC12細胞に2nMのNGFを投与して、発現させたTrkA-GFPの蛍光強度を経時的に計測した結果、NGF投与からの時間に従い、蛍光強度が低下する現象を発見した。この蛍光強度の時間変化を1次の指数関数でフィットすると、その時定数は172sとなった。この値は、後根節神経細胞成長円錐におけるNGF取り込みの1分子観察から推定された、TrkA活性化の時間経過とよく一致した。

Research Products

• [Journal Article] An ultramarine fluorescent protein with increased photostability and pH insensitivity (2009)
  • Author(s): Tomosugi W., Matsuda T., T ani T., Nemoto T., Kotera I. Saito K., Horikawa K. and Nagai T.
  • Journal Title: Nature Methods(published online : 6 April 2009)
  • NAID: 120001648573
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] A mercury arc lamp-based multi-color confocal real time imaging system for cellular structure and function (2008)
  • Author(s): Saito K., Kobayashi K., Tani T and Nagai T.
  • Journal Title: Cell Structure and Function 33 Pages: 133-141
  • NAID: 130004137533
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Direct measurement of protein dynamics inside cells using a rationally designed photoconvertible protein. (2008)
  • Author(s): Matsuda, T, Miyawaki, A. and Nagai, T.
  • Journal Title: Nature methods 5 Pages: 339-345
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Unc-51-like kinase 1/2 mediated endocytic processes regulate filopodia extension and branching of sensory axons. (2007)
  • Author(s): Zhou, X., Babu, J. R., da Silva, S., Shu, Q., Graef, I. A., Oliver, T., Tomoda, T., Tani, T., Wooten, M. W. and Wang, F.
  • Journal Title: Proc. Natl. Acad. Sci. USA 104 Pages: 5842-5847
  • Peer Reviewed
• [Presentation] Single molecule analysis of NGF and the receptor trafficking on growth cones (2009)
  • Author(s): Tomomi Tani
  • Organizer: EMBO Conference Series on Spatial Dynamics of Intracellular Signaling
  • Place of Presentation: Maale Hachmisha(Jerusalem, Israel)
• [Presentation] 情報伝達する分子同士の向きを見る-蛍光偏光からのアプローチ- (2008)
  • Author(s): 谷知己
  • Organizer: 2分子計測ワークショップ
  • Place of Presentation: 東京大学本郷キャンパス(東京)
  • Year and Date: 2008-12-09
• [Presentation] 神経栄養菌子受容体の逆行性軸索輸送-その可視化と生理機能解明へのアプローチ (2008)
  • Author(s): 谷知己
  • Organizer: ダイニン研究会
  • Place of Presentation: 筑波大学下田臨海実験センター(下田)
• [Presentation] Trapping single molecules of GFP-tagged nerve growth factor receptor vialigands immobilized on a solid surface (2008)
  • Author(s): Tomomi Tani, Kenta Saito and Takeharu Nagai
  • Organizer: 第46回日本生物物理学会年会
  • Place of Presentation: 福岡国際会議場(福岡)
• [Presentation] リガンド結合にともなう神経成長因子受容体TrkAの構造ダイナミクスを可視化する試み (2007)
  • Author(s): 谷知己・斉藤健太・永井健治
  • Organizer: 日本生物物理学会年大会
  • Place of Presentation: 横浜・パシフィコ横浜
  • Year and Date: 2007-12-23
• [Presentation] 切断された神経軸索の再生における神経成長因子の作用 (2007)
  • Author(s): 野村真未・原田慶恵・谷知己
  • Organizer: 日本生物物理学会年大会
  • Place of Presentation: 横浜・パシフィコ横浜
  • Year and Date: 2007-12-21
• [Book] スパイは一人で充分-蛍光タンパク質を用いた蛍光1分子イメージング(分担執筆) (2007)
  • Author(s): 谷知己・永井健治
  • Total Pages: 185
  • Publisher: 羊土社