Research Project
Grant-in-Aid for Exploratory Research
本研究では、国際プロジェクトとして急速に構築が進んでいる変異ES細胞バンクのリソースを効率的に利用して表現型解析を加速化するために、片アレル変異体(ヘテロ変異体)から両アレル変異体(ホモ変異体)を迅速に誘導する手法の開発を試みた。具体的には、RNAi法を用いてBloom遺伝子の発現を抑制することで、相同染色体間の組換え効率を高め、その結果として両アレル変異体を誘導することを期待した。Nanog遺伝子座の一方のアレルへ単純ヘルペスウイルス由来チミジンキナーゼ遺伝子をノックインしたES細胞に対して、Bloom遺伝子に対する標的配列を有すRNAi用レトロウイルスベクターを導入した。Bloom遺伝子の発現抑制によりNanog遺伝子座の両アレルが野生型に変換されると、ES細胞がガンシクロビールに耐性になると予想した。しかし、耐性細胞の出現効率の上昇は認められなかった。そこで、相同染色体間組換えに対して、Bloom遺伝子と共同して作用すると報告されている遺伝子に着目し、その遺伝子の活性を、RNAi法を用いてBloom遺伝子とともに抑制することで、ホモ変異体の出現効率を上昇させることを試みた。しかし、RNAi法による効果的な遺伝子発現抑制は困難で、成功には至らなかった。RNAi法での効率的ホモ変異体単離は困難であったことから、我々が以前から用いていた、「テトラサイクリンシステムによるBloom遺伝子発現抑制を介したホモ変異体単離法」のプロトコールを改善することに方向転換し、結果的に、ホモ変異体の迅速な単離が可能となった。また、本研究で開発したRNAiベクターは、ホモ変異体の表現型解析のための一般的手法として役立てることができた。
