| Project/Area Number |
19651092
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| Research Category |
Grant-in-Aid for Exploratory Research
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| Allocation Type | Single-year Grants |
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| Research Field |
Living organism molecular science
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| Research Institution | Kyoto University |
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Principal Investigator |
森井 孝 Kyoto University, エネルギー理工学研究所, 教授 (90222348)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
藤枝 伸宇 京都大学, 次世代開拓研究ユニット, 助教 (00452318)
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| Project Period (FY) |
2007 – 2008
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| Project Status |
Completed (Fiscal Year 2008)
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| Budget Amount *help |
¥3,400,000 (Direct Cost: ¥3,400,000)
Fiscal Year 2008: ¥1,600,000 (Direct Cost: ¥1,600,000)
Fiscal Year 2007: ¥1,800,000 (Direct Cost: ¥1,800,000)
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| Keywords | メタンモノキシゲナーゼ / タンパク質工学 / 鉄錯体 / メタン酸化 / タンパク質フォールディング / ミニチュアタンパク質 / バイオエネルギー / 立体構造デザイン / メタンモノオキシゲナーゼ |
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| Research Abstract |
タンパク質酵素は天然の状態では不安定なものが多く、扱いが困難である。本研究では、安定なタンパク質酵素単量体を作製するために、これまでほとんど考慮されていないタンパク質表面の改変に注目した。タンパク質の立体構造を変えることなくタンパク質表面を改変し、安定に折りたたまれる単量体タンパク質を設計する方法論を確立するため、本研究では、メタンモノオキシゲナーゼの構成ユニットであるメタンハイドロキシラーゼ(MMOH)を構成する6量体のうち、MMOHの活性部位を含むαサブユニットをもとにして単量体かつ安定なミニチュアメタン酸化酵素を作製することを目的とした。
そのため、(1)MMOHαサブユニットN末端とC末端の内、立体構造形成に関与が少ないと思われる部位を削除し、分子量を下げた。次に、(2)表面残基のうち疎水性パッチを形成している部位に着目し、タンパク質立体構造データベースからその部位と類似した三次元構造を探索し、探索された構造の親水性表面をMMOHαサブユニットに移植することでMMOHαサブユニット可溶性の増大を図った。
立体構造データベースから探索した親水性の表面構造を移植したαサブユニット変異体群は大腸菌発現系において不溶性画分に発現した。この画分から各変異体を単離・精製し、希釈によるリフォールディングを試みところ、いくつかの変異体は中性pHにおいても可溶化することが分かった。また、いくつかの可溶性αサブユニット変異体について、Co(II)イオンの配位と円二色性スペクトルの解析による立体構造形成が確認された。本研究の成果により、多量体タンパク質酵素のサブユニットをもとにして、タンパク質表面を改変することにより、安定な単量体タンパク質が構築できる可能性が示された。
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