制限酵素を用いたヒトゲノム上へのDNA二重鎖切断導入とその修復課程の解析

• Project/Area Number: 19657004
• Research Category: Grant-in-Aid for Challenging Exploratory Research
• Allocation Type: Single-year Grants
• Research Field: Genetics/Genome dynamics
• Research Institution: Osaka University
• Principal Investigator: 篠原 美紀 Osaka University, 蛋白質研究所, 准教授 (80335687)
• Project Period (FY): 2007 – 2009
• Project Status: Completed (Fiscal Year 2009)
• Budget Amount: ¥3,500,000 (Direct Cost: ¥3,500,000); Fiscal Year 2009: ¥1,000,000 (Direct Cost: ¥1,000,000); Fiscal Year 2008: ¥1,000,000 (Direct Cost: ¥1,000,000); Fiscal Year 2007: ¥1,500,000 (Direct Cost: ¥1,500,000)
• Keywords: DNA傷害修復 / DNA二重鎖切断 / 非相同末端結合 / 相同組換え

Research Abstract

本研究の目標はヒト細胞内におけるDNA二重鎖切断の修復の過程を明らかにする上で、今必要なものは、ゲノム上に部位特異的に同調的にDNA二重鎖切断(DSB)を導入しその修復過程の経時変化をモニターすることができる系を確立することである。ヒト培養細胞HeLaS3細胞およびヒト正常リンパ球細胞を用いて、制限酵素BamHIにより生細胞中でDSBを導入させ、その修復過程について解析を行った。今年度は、おもに制限酵素により導入されたDSB部位のヒトゲノム上での位置の特定を行うことを目標として解析を行った。DSB末端に相補的な末端を持つ、ビオチンラベルしたオリゴDNAによりキャッピングを行い、ストレプトアビジンビーズにより回収してDSB末端の塩基配列を決定した。その結果、ヒトゲノム上で約200カ所の高頻度でDSBが入る部位を特定することができた。その中でも特に頻度が高かった部位について、クロマチン免疫沈降法を行った。DSB末端プールからDSB依存的に特定領域を検出することができたが、修復タンパク質に対する抗体を用いた、免疫沈降産物からのクロマチン免疫沈降法特定領域の検出にはいたらなかった。さらに検出条件の検討を行うことにより、改善可能だと考えている。逆に特定部位にこだわらず、全ゲノム上のDSB末端の濃縮方法を確立したことからゲノムワイドなDSBの分布とゲノム上の構造あるいは様々な染色体上の蛋白質の分布との比較が可能になった。ゲノム安定化における脆弱部位の特定や、今後、この手法を用いてゲノム安定化に寄与するタンパク質とその修飾状態等の要因究明に多いに貢献できると考えている。

Research Products

• [Journal Article] 減数分裂期組換え制御の分子メカニズム (2009)
  • Author(s): 篠原美紀
  • Journal Title: 蛋白質核酸酵素 54 Pages: 466-471
• [Journal Article] FHA domain of yeast Xrs2, a homolog of human Nbsl, promotes non-homologous end joining through the interaction with a Ligase-IV partnerprotein, Lifl (2008)
  • Author(s): Matsuzaki, K
  • Journal Title: Genetics 179 Pages: 213-215
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Rapid telomere movement in meiotic prophase is promoted by NDJl, MPS3 and CSM4 amd is modurated by recombination (2008)
  • Author(s): Conrad, M
  • Journal Title: Cell 133 Pages: 1175-1187
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Csm4-dependent telomere movement on nuclear envelope promotes meiotic recombination (2008)
  • Author(s): Kosaka, H
  • Journal Title: PLoS Genet 4
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] タンパク質リン酸化を介したDNA二重鎖切断制御の分子メカニズム (2008)
  • Author(s): 篠原美紀
  • Journal Title: 生化学 80 Pages: 1029-1033
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Crossover assurance and crossover interference are distinctly regulated by the ZMM proteins during meiosis. (2008)
  • Author(s): Shinohara, M
  • Journal Title: Nature Genetics 40 Pages: 299-309
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Rad52 promotes postinvasion steps of meiotic dounle-strand-break repair (2008)
  • Author(s): Lao J,
  • Journal Title: Mol. Cell 29 Pages: 517-524
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] FHA domain of yeast Xrs2, a homologue of human Nbsl, promotes non-homologous end joining through the interaction with a Ligase IV partner protein, Lifl (2008)
  • Author(s): Matsuzaki K
  • Journal Title: Genetics (in press)
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Distinct functions of the two specificity-determinants in replication initiation of the plasmids ColE2-P9 and ColE3-CA38 (2007)
  • Author(s): Aoki, Kazuaki
  • Journal Title: J Bacteriol 19 Pages: 2392-2400
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Meiotic recombination-related DNA synthesis and its implications for cross-over and non-cross-over recombinant formation (2007)
  • Author(s): Terasawa, M,
  • Journal Title: Proc Natl. Acad. Sci. USA 104 Pages: 5965-5970
  • Peer Reviewed
• [Presentation] Cyclin-dependent Kinase (CDK) Regulates the NHEJ Activity during SG2 Phase in Budding Yeast (2009)
  • Author(s): 篠原美紀
  • Organizer: Switzerland-Japan Joint meeting on the Molecular Mechanisms Regulating Chromosome Dynamics and Genome Stability
  • Place of Presentation: Villars-sur-Ollon, Switzerland
• [Presentation] Molecular function of ZMM & 9-1-1 complex in meiotic crossover formation (2009)
  • Author(s): 篠原美紀
  • Organizer: EMBO Conference series on MEIOSIS
  • Place of Presentation: L'Isle sur la Sorgue, France
• [Presentation] パキテンチェックポイントにおけるヒストン修飾の機能 (2009)
  • Author(s): 篠原美紀
  • Organizer: 特定領域研究「生殖系列の世代ザイクルとエピゲノムネットワーク」第2回 公開シンポジウム
  • Place of Presentation: 東京 品川 コクヨホール
• [Presentation] Molecular function of ZMM and 9-1-1 in meiotic crossover formation DNA損傷応答因子9-1-1とZMM因子の減数分裂期組換えにおける分子機能 (2009)
  • Author(s): 篠原美紀
  • Organizer: 日本分子生物学会 第32回年会
  • Place of Presentation: 横浜 パシフィコ横浜
• [Presentation] CDKによる非相同末端結合の新規メカニズムの解析 (2009)
  • Author(s): 松嵜健一郎
  • Organizer: 日本遺伝学会第81回大会
  • Place of Presentation: 信州大学
• [Presentation] Analysis of a novel regulatory mechanism of NHEJ by CDK (2009)
  • Author(s): 松嵜健一郎
  • Organizer: Keystone Synposia Telomere Biology and DNA repair
  • Place of Presentation: RACV Royal Pines Resort, Queensland, Australia
• [Presentation] CDKによる非相同末端結合の新規メカニズムの解析 (2009)
  • Author(s): 松嵜健一郎
  • Organizer: 2009年度 複製・組換え・修復ワークショップ
  • Place of Presentation: 琵琶湖カンファレンスセンター 大津
• [Presentation] Analysis of a novel regulatory mechanism of NHEJ by CDK (2009)
  • Author(s): 松嵜健一郎
  • Organizer: 日本分子生物学会 第32回年会
  • Place of Presentation: 横浜 パシフィコ横浜
• [Presentation] FHA domain of yeast Xrs2 promotes non-homologous end joining through theinteraction with aliease-IV Dartner Drotein lifl (2008)
  • Author(s): Shinohara M
  • Organizer: EMBO Workshop
  • Place of Presentation: II Ciocco, Italy
• [Presentation] Crossover Assurance and Crossover Interference are Distinctly Regulated by theZMM/SiC Proteins dnring /Meiosis (2008)
  • Author(s): Shinohara M
  • Organizer: Genetics-Understanding Living SystemsXX International Congress of Genetics
  • Place of Presentation: Berlin, Germany
• [Presentation] 減数分裂期交叉型組換えの制御機構の解明 (2008)
  • Author(s): 篠原美紀
  • Organizer: 酵母遺伝学フォーラム
  • Place of Presentation: 北海道大学
• [Presentation] Molecular functions of ZMM/SIC complex during meiosis in Saccharomyces cerevisiae (2008)
  • Author(s): Shinohara M
  • Organizer: 3R Symposium
  • Place of Presentation: っま恋
• [Presentation] 非相同末端結合における酵母Xrs2の機能と細胞周期による制御 (2008)
  • Author(s): 篠原美紀
  • Organizer: 日本放射線影響学会
  • Place of Presentation: 北九州国際会議場
• [Presentation] Molecular mechanism of regulation in meiotic crossover formation (2008)
  • Author(s): 篠原美紀
  • Organizer: 日本分子生物学会年会
  • Place of Presentation: 神戸国際会議場
• [Presentation] 減数分裂期組換えにおけるATM/ATRキナーゼの機能 (2008)
  • Author(s): 篠原美紀
  • Organizer: 染色体ワークショップ
  • Place of Presentation: ウェルサンピア姫路
• [Presentation] 減数分裂期の組換えにおけるシナプトネマ複合体の機能解析Functional analysis of Synaptnemal complex in meiotic recombination (2007)
  • Author(s): 篠原美紀
  • Organizer: 日本分子生物学会
  • Place of Presentation: 横浜国際会議場
  • Year and Date: 2007-12-13
• [Presentation] FHA domain of yeast Xrs2 promotes non-homologous end joining through the interaction with a Ligase-IV partner protein, Lifl (2007)
  • Author(s): Miki Shinohara
  • Organizer: International Symposium on "Chromosome and Genome Stability & Instability"
  • Place of Presentation: 千里ライフサイエンスセンター
  • Year and Date: 2007-11-08
• [Presentation] Molecular functions of ZMM/SIC complex during meiosis in Sacchar omyces cerevisiae (2007)
  • Author(s): Miki Shinohara
  • Organizer: The 8th European Meiosis Meeting
  • Place of Presentation: Shonan Village Center, Kanagawa, Japan.
  • Year and Date: 2007-09-13
• [Presentation] シナプトネマ複合体の構成因子の減数分裂期相同組換え制御機構 (2007)
  • Author(s): 篠原美紀
  • Organizer: 日本遺伝学会 第79回大会
  • Place of Presentation: 岡山大学
  • Year and Date: 2007-09-13
• [Presentation] Liflのリン酸化による非相同末端結合制御機構 (2007)
  • Author(s): 篠原美紀
  • Organizer: 酵母遺伝学フォーラム
  • Place of Presentation: 大阪大学
  • Year and Date: 2007-09-11
• [Presentation] FHA domain of yeast Xrs2 promotes non-homologous end joining through the interaction with a Ligase-IV partner protein, Lifl (2007)
  • Author(s): M. Shinohara
  • Organizer: FASEB summer conference
  • Place of Presentation: Snowmass Village, Colorado
  • Year and Date: 2007-07-28
• [Remarks]
  • URL: http://www.protein.osaka-u.ac.jp/