核酸4重鎖構造をベースにした核酸性イオンチャネルの創製

• Project/Area Number: 19657034
• Research Category: Grant-in-Aid for Exploratory Research
• Allocation Type: Single-year Grants
• Research Field: Structural biochemistry
• Research Institution: Yokohama City University
• Principal Investigator: 片平 正人 Yokohama City University, 国際総合科学研究科, 教授 (70211844)
• Project Period (FY): 2007
• Project Status: Completed (Fiscal Year 2007)
• Budget Amount: ¥3,700,000 (Direct Cost: ¥3,700,000); Fiscal Year 2007: ¥3,700,000 (Direct Cost: ¥3,700,000)
• Keywords: 4重鎖 / 核酸 / イオンチャネル / リポソーム / 蛍光顕微鏡 / 立体構造

Research Abstract

リポソームに4重鎖構造を形成させた核酸を埋め込み、これがイオンチャネルとして動作するのかを検証した。検証には以下の3つの手法を用いた。
(1)蛍光顕微鏡を用いた検証
ジャイアントリポソームの内側にカルシウムイオンとその蛍光性指示薬であるFura2を封入した。蛍光顕微鏡でFura2の蛍光強度を追跡する事で、4重鎖を通じたカルシウムイオンの流出の有無を検証した。15分程度での蛍光強度の減少が観測され、4重鎖核酸がチャネルとして動作する事が示唆された。
(2)イオン特異的電極を用いた検証
リポソーム内にカリウムイオンを封入し、これをカリウムイオンを含まない溶液に移した。カリウムイオンに特異的な電極を用いて溶液中のカリウムイオン濃度をモニターする事で、4重鎖を通じたカリウムイオンの流出の有無を検証した。数秒程度及び15分程度の2つの時間領域において容液のカリウムイオン濃度の上昇が観測され、4重鎖核酸がチャネルとして動作する事が示唆された。
(3)蛍光分光器を用いた検証
リポソーム内のカリウムイオン濃度とpHと外液より高く決定する。また蛍光性pH指示薬であるHPTSも同時にリポソーム内に封入する。ここにプロトンイオノフォアであるCCCPを添加する。この時、カリウムイオンの流出とプロトンの流出がカップルして生じれば、リポソーム内のpHが低下し、それがHPTSの蛍光変化(減少)として観測されると予想される。CCCP添加時のHPTSの蛍光強度を蛍光分光器でモニターする事によって、4重鎖を通じたカリウムイオン流出の受けを検証した。数秒程度及び15分程度の2つの時間領域において蛍光強度の減少がされ、4重鎖核酸がチャネルとして動作する事が示唆された。
以上の(1)〜(3)の検証より、4重鎖核酸がイオンチャネルとして動作する可能性が示唆された。今後は4重鎖以外の核酸を用いて同様の実験を行う事で、この可能性をさらに検証していく予定である。

Research Products

• [Journal Article] Unexpected A-form formation of 4'-thioDNA in solution, revealed by NMR, and the implications as to the mechanism of nuclease-resistance (2008)
  • Author(s): Matsugami, A., Ohyama, T., Inada, M., Inoue, N., Minakawa, N., Matsuda, A., Katahira, M.
  • Journal Title: Nucleic Acids Res. 36 Pages: 1805-1812
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Structure of human telomeric DNA under physiological ionic conditions stabilized by proper incorporation of 8-bromoguanosines, as determined (2007)
  • Author(s): Matsugami, M., Xu, Y., Noguchi, Y., Sugiyama, H. and Katahira, M.
  • Journal Title: FEBS J. 274 Pages: 3545-3556
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Structural analysis of the fundamental polymer of the sheath constructed by Sphaerotilus natans (2007)
  • Author(s): Takeda, M., Miyanoiri, Y., Nogami, T., Oda, K., Saito, T., Kato, K., Koizumi, J. I., Katahira, M.
  • Journal Title: Biosci. Biotechnol. Biochem. 71 Pages: 2992-2998
  • NAID: 10027522051
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Interactions with RNA/DNA of proteins involved in the regulation of transcription, translation and telomere elongation (2007)
  • Author(s): Ohyama, T., Furukawa, A., Miyoshi, T., Takada, Y., Ohgara, S., Hiratsuka, K., Imai, T., Okano, H., Nakagama, H., Nagata, T. and Katahira, M.
  • Journal Title: Nucleic Acids Symp. Ser. 51 Pages: 77-78
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Structure of 4'-thioDNA which exhibits endonuclease resistance (2007)
  • Author(s): Matsugami A., Ohyama, T., Inada, M., Inoue, N., Minakawa, N., Matsuda, A. and Katahira, M.
  • Journal Title: Nucleic Acids Symp. Ser. 51 Pages: 141-142
  • Peer Reviewed
• [Presentation] Attempt to construct the ion channel composed of nucleic acids (2008)
  • Author(s): Katahira, M.
  • Organizer: International Symposium on Membrane Interface
  • Place of Presentation: Fukuoka
  • Year and Date: 2008-01-25
• [Presentation] 核酸性人工イオンチャネル創製の試み (2007)
  • Author(s): 三好達也
  • Organizer: 第30回日本分子生物学会年会・第80回日本生化学会大会 合同大会
  • Place of Presentation: 横浜
  • Year and Date: 2007-12-12
• [Book] 生物物理学ハンドブック(分担) (2007)
  • Author(s): 片平正人
  • Publisher: 朝倉書店
• [Book] 生命科学のための機器分析実験ハンドブック(分担) (2007)
  • Author(s): 大山貴子、松上明正、片平正人
  • Publisher: 羊土社