• Search Research Projects
  • Search Researchers
  • How to Use
  1. Back to previous page

p53ホモ四量体形成ミュータントの探索-新規タンパク質間相互作用検出系の創出

Research Project

Project/Area Number 19657037
Research Category

Grant-in-Aid for Exploratory Research

Allocation TypeSingle-year Grants
Research Field Functional biochemistry
Research InstitutionHokkaido University

Principal Investigator

今川 敏明  Hokkaido University, 大学院・先端生命科学研究院, 准教授 (20142177)

Project Period (FY) 2007 – 2008
Project Status Completed (Fiscal Year 2008)
Budget Amount *help
¥3,600,000 (Direct Cost: ¥3,600,000)
Fiscal Year 2008: ¥1,000,000 (Direct Cost: ¥1,000,000)
Fiscal Year 2007: ¥2,600,000 (Direct Cost: ¥2,600,000)
Keywordsp53 / 四量体形成ドメイン / 無細胞タンパク質合成 / cDNAライブラリー / 癌抑制タンパク質 / 蛍光エネルギー移動 / ピューロマイシン / 蛍光融合タンパク質 / 無細胞タンパク質合成系 / 自己切断型リボザイム / Puromycin / タンパク質間相互作用 / Two-hybrid / Na / K-ATPase
Research Abstract

本年度研究計画1)p53四量体形成ドメイン変異体cDNAライブラリーの作製とスクリーニングに関して、ランダムオリゴプライマーを用いてMycタグ-p53四量体形成ドメインペプチド(p53TD)およびp53TD-HAタグをコードするcDNAライブラリーをPCR法によって作成し、それらを鋳型にin vitro transcriptionによってmRNAライブラリーを作製した。C-末端にHAタグを含むp53TDをコードするmRINAライブラリーについては、3'-末端にピューロマイシンを含むオリゴヌクレオチドをT4RNAリガーゼを用いて共有結合させた。これらmRNAライブラリーをHisタグ-野生型p53TDをコードするmRNAとともに、コムギ胚芽無細胞タンパク質合成系で同時に翻訳し、合成されたペプチド混合液から、抗His抗体磁気ビーズを用いてHisタグ-野生型p53四量体形成ドメインペプチドと複合体を形成したペプチドを除去し、さらに抗Myc抗体磁気ビーズに結合しないペプチドを除去した。抗Myc抗体磁気ビーズに結合したMycタグ-p53TDペプチドと複合体を形成しているp53TD-HAペプチドのC-末端にピューロマイシンを介して付加しているmRNAを鋳型として、HAタグに対する特異的プライマーを用いて逆転写反応を行った。その後、p53TD-HA領域をコードするcDNAをPCRによって増幅し、His-野生型p53TDとは四量体を形成できないが、Myc-p53-TD変異体とは複合体を形成できるp53TD変異体ペプチドをコードするDNA配列を決定した。この過程を繰り返すことで、野生型p53とは四量体を形成できないが、変異体同士では四量体を形成できるホモ四量体形成p53変異体の候補配列を、数種類得ることができた。
これら得られたp53TDドメインペプチド配列を含む全長p53と野生型p53との四量体形成能およびp53変異体の転写活性化能を検討するために、二種類の蛍光融合タンパク質p53間に起こる蛍光エネルギー移動によって四量体形成能を解析する実験系および生細胞を用いてp53の発現量と転写活性を同時にモニターできる実験系を構築した。

Report

(2 results)
  • 2008 Annual Research Report
  • 2007 Annual Research Report
  • Research Products

    (3 results)

All 2009 2008 2007

All Journal Article (1 results) (of which Peer Reviewed: 1 results) Presentation (2 results)

  • [Journal Article] Evaluation of Transcriptional Activity of p53 in Individual Living Mammalian Cell2009

    • Author(s)
      Imagawa, T, Terai, T., Yamada, Y., Kamada. R.. and Sakaguchi, K.
    • Journal Title

      Anal. Biochem 387

      Pages: 249-256

    • Related Report
      2008 Annual Research Report
    • Peer Reviewed
  • [Presentation] がん抑制タンパク質p53のリン酸化部位変異体の転写活性と安定性2008

    • Author(s)
      今川敏明、大島祥吾、坂口和靖
    • Organizer
      第31回日本分子生物学会年会・第81回日本生化学会大会合同大会
    • Place of Presentation
      神戸
    • Year and Date
      2008-12-11
    • Related Report
      2008 Annual Research Report
  • [Presentation] Stability of oligomeric structure is the key factor for transcriptional activity in tumor suppressor protein p532007

    • Author(s)
      今川敏明
    • Organizer
      第30回日本分子生物学会年会・第80回日本生化学会大会 合同大会
    • Place of Presentation
      横浜
    • Year and Date
      2007-12-13
    • Related Report
      2007 Annual Research Report

URL: 

Published: 2007-04-01   Modified: 2016-04-21  

Information User Guide FAQ News Terms of Use Attribution of KAKENHI

Powered by NII kakenhi