| Project/Area Number |
19657055
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| Research Category |
Grant-in-Aid for Exploratory Research
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| Allocation Type | Single-year Grants |
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| Research Field |
Cell biology
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| Research Institution | Tohoku University |
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Principal Investigator |
中山 啓子 Tohoku University, 大学院・医学系研究科, 教授 (60294972)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
舟山 亮 東北大学, 大学院・医学系研究科, 助教 (20452295)
山田 秀俊 東北大学, 大学院・医学系研究科, 助手 (70511955)
原 賢太郎 東北大学, 大学院・医学系研究科, COEフェロー (60400248)
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| Project Period (FY) |
2007 – 2008
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| Project Status |
Completed (Fiscal Year 2008)
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| Budget Amount *help |
¥3,500,000 (Direct Cost: ¥3,500,000)
Fiscal Year 2008: ¥1,300,000 (Direct Cost: ¥1,300,000)
Fiscal Year 2007: ¥2,200,000 (Direct Cost: ¥2,200,000)
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| Keywords | 細胞増殖 / 分化 / 細胞内小器官 / 蛍光ラベル / レンチウィルス / Geminin / histoneH3.1 / 蛍光タンパク質 / ノックアウトマウス / セントリンII |
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| Research Abstract |
核膜を標識するためにラミンBを、中心体の標識にセントリン2を、細胞膜の標識にβ-カテニン、E-カドヘリンを用いた積まず、これらのタンパク質のcDNAをRT-PCRにて取得し、そのcDNAの5'側または3'側に蛍光色素をコードするcDNAをin frameで連結し、標識タンパク質と蛍光色素の融合タンパク質をコードするcDNAを作製した。融合タンパク質のcDNAを発現ベクターにクローニングし、腫瘍細胞へ発現し、蛍光顕微鏡にて観察し、融合タンパク質が、予想された目的とする細胞内局在をとることを確認した。
このベクターを鋳型にRNA polymeraseを用いて転写反応を行い、RNAを作製した。さらにpoly Aを付加した後、精製し、注入用RNAとした。このRNAをマウス一細胞期胚に注入した。RNA注入後、48時間後に蛍光顕微鏡で観察し、期待される細胞内局在をとっているか、胚の発生は正常に進行しているかを判定した。さらにこの胚を固定し、各小器官に特有のタンパク質に対する抗体で、免疫染色を行い、発現させた融合タンパク質と共局在することを確認した。その結果、ラミンBおよびE-カドヘリンは、有用なツールであることが判明したが、中心体を標識するセントリン2は、発現が弱く明瞭な染色が得られなかった。
ラミンBおよびE-カドヘリンは、さらに継時的に観察をタイムラプス蛍光顕微鏡で行った。RNA注入12時間後より、30分ごとに96時間までの観察を行い。この間の蛍光強度の変化を調べたところ、いずれも96時間の間に蛍光強度は減衰するものの、観察は可能であることが判明した。
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