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In vivo光架橋実験によるタンパク質膜透過装置の相互作用ネットワーク解析

Research Project

Project/Area Number 19657061
Research Category

Grant-in-Aid for Exploratory Research

Allocation TypeSingle-year Grants
Research Field Cell biology
Research InstitutionKyoto University

Principal Investigator

森 博幸  Kyoto University, ウイルス研究所, 准教授 (10243271)

Project Period (FY) 2007 – 2008
Project Status Completed (Fiscal Year 2008)
Budget Amount *help
¥3,600,000 (Direct Cost: ¥3,600,000)
Fiscal Year 2008: ¥1,700,000 (Direct Cost: ¥1,700,000)
Fiscal Year 2007: ¥1,900,000 (Direct Cost: ¥1,900,000)
Keywordsin vivo光架橋 / SecA / タンパク質膜透過 / SecY / SecG / translocon / pBPA / アミノ酸アナログ / SecYEG / SecDF / Protein translocation
Research Abstract

タンパク質膜透過装置SecYEGのサブユニットの1つであるSecGの全領域(2本の膜貫通領域と細胞質領域、ペリプラズム領域各1つ)を対象に、計37個のamber変異体をplasmid上に作製し、この部位にpBPAを導入したin vivo光架橋実験を行った。その結果、SecGの細胞質領域は、モータ因子SecA ATPase,チャネルの基幹因子SecYと近接していることが明らかとなった。これら因子との相互作用部位は、重複しているが、その作用様式は、SecAのヌクレオチド結合状態に依存して変化し、ATP結合型の条件では、SecAはSecGにより近接することを見いだした。加えて、SecGの第2の膜貫通領域内にpBPAを導入したある変異体においては、SecYとの間で架橋複合体を形成することを明らかにした。この結果は、本in vivo光架橋実験は、膜貫通領域内の相互作用解析においても有用であることを示している。更に、SecGの第2の膜貫通領域と細胞質領域の境界に位置する52番目、あるいはペリプラズム領域との境界に位置する72番目のアミノ酸をpBPAに改変したSecG変異体を用いた場合には、既存のSec因子に対する抗体とは反応せず、電気泳動上移動度の異なる新たな架橋複合体のバンドが検出された。C末端に付加したHis6タグ配列を利用した親和クロマトグラフィーにより架橋複合体を精製し、質量分析により相手の同定を行った所、前者は、機能未知の細胞質膜タンパク質であることが明らかとなった。現在、同定された因子が真に架橋パートナーであるかどうかの検証を進めている。
以上のように、部位特異的in vivo光架橋実験は、既存因子のみならず、未知因子との相互作用解析にも威力を発揮する画期的手法として、今後の応用が期待される。

Report

(2 results)
  • 2008 Annual Research Report
  • 2007 Annual Research Report
  • Research Products

    (3 results)

All 2008

All Journal Article (1 results) (of which Peer Reviewed: 1 results) Presentation (2 results)

  • [Journal Article] Conformational transition of Sec machinery inferred from bacterial SecYE structures.2008

    • Author(s)
      Tsukazaki, T., Mori, H., et al. (計11名)
    • Journal Title

      Nature 455

      Pages: 988-991

    • NAID

      10025975982

    • Related Report
      2008 Annual Research Report
    • Peer Reviewed
  • [Presentation] Crystal structure of T. thermophilus Sec translocon with an Fab fragment implies a translocation-initiating state of SecY.2008

    • Author(s)
      Tsukazaki, T., Mori, H., et al. (計11名)
    • Organizer
      第31回日本分子生物学会年会、第81回日本生化学会大会 合同大会
    • Place of Presentation
      神戸国際会議場
    • Year and Date
      2008-12-12
    • Related Report
      2008 Annual Research Report
  • [Presentation] SecA ATPaseはどのようにtransloconと相互作用し、タンパク質膜透過を駆動しているのか?2008

    • Author(s)
      森 博幸、塚崎智也, 濡木理、伊藤維昭
    • Organizer
      大阪大学蛋白質研究所セミナー「蛋白質の膜透過と膜挿入の分子メカニズム」
    • Place of Presentation
      大阪(大阪大学蛋白質研究所)
    • Year and Date
      2008-01-25
    • Related Report
      2007 Annual Research Report

URL: 

Published: 2007-04-01   Modified: 2016-04-21  

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