Development of phenotypic drug susceptibility assay for HIV-1 in biosafety level (BSL)-2 facility

• Project/Area Number: 19790401
• Research Category: Grant-in-Aid for Young Scientists (B)
• Allocation Type: Single-year Grants
• Research Field: Laboratory medicine
• Research Institution: National Institute of Infectious Diseases
• Principal Investigator: FUJINO Masayuki National Institute of Infectious Diseases, エイズ研究センター, 研究員 (50392329)
• Project Period (FY): 2007 – 2008
• Project Status: Completed (Fiscal Year 2008)
• Budget Amount: ¥3,780,000 (Direct Cost: ¥3,300,000、Indirect Cost: ¥480,000); Fiscal Year 2008: ¥2,080,000 (Direct Cost: ¥1,600,000、Indirect Cost: ¥480,000); Fiscal Year 2007: ¥1,700,000 (Direct Cost: ¥1,700,000)
• Keywords: 臨床検査医学 / HIV-1 / 臨床検査 / 薬剤耐性 / バイオセーフティ

Research Abstract

HIV薬剤感受性検査は遺伝子検査とは異なり耐性の程度を定量化できることや、既知の耐性変異以外による耐性の検出ができることから、迅速かつ簡便な検査法の確立が望まれている。しかし、日本では、HIV-1の取扱がBSL-3に限定される事から、BSL-2施設しか持ち合わせていない機関においては、HIV-1の薬剤感受性検査を行う事は非常に難しい。この研究では、薬剤耐性HIV-1の薬剤感受性検査をBSL-2施設にて簡便に効率良く行う事が出来る系の構築を目的とした。現在主に遺伝子導入実験に用いられているHIV-1 vectorはBSL-2での使用が可能である。本研究ではHIV-1 vectorのpol領域にHIV-1感染者由来のpolをIn-Fusionクローニングシステムにより簡便に組み換える事が出来る様に改変した。またHIV-1 vector感染の指標としてLuciferase遺伝子を組み込んだ。作製したHIV-1 vectorを感染させたMT-2細胞は、感染量依存的なLuciferase活性を示し、既存の抗HIV薬剤に対して薬剤濃度依存的なLuciferase活性低下を示した。プロテアーゼ阻害剤に耐性である84V/90Mの変異ウイルスにおいては、SQVでは2.0倍、NFVに対しては4.3倍の耐性を示した。核酸系逆転写酵素阻害剤耐性の41L/67L/70R/215Y変異ウイルスにおいてはAZTに対して265倍、184V変異ウイルスにおいては3TCに対して100倍以上の耐性を示した。非核酸系逆転写酵素阻害剤耐性の103N変異ウイルスにおいてはNVPに対して10倍以上、190S変異ウイルスにおいてはEFVに対して92倍の耐性を示す事が確認された。これらの結果から、HIV-1 vectorを用いた本薬剤感受性検査方法は、BSL-2におけるHIV-1薬剤感受性検査に利用可能であると考えられた。HIV-1感染者血漿由来の薬剤耐性HIV-1からpol領域をRT-PCRにて増幅したのち、In-FusionクローニングシステムにてHIV-1 vectorへのクローニングを行い、野生型のHIV-1 vectorとの薬剤感受性の比較を行った。同時に感染者血漿由来のHIV-1 pol領域の遺伝子配列に対して、HIV-1の遺伝子検査を行う際に最もよく用いられているStanford大学のHIV-1 genotypingシステムを用い、薬剤耐性の推定を行った。その結果、本HIV薬剤感受性検査法によって得られた感染者由来のHIV-1の薬剤耐性度は、Stanford大学のgenotypingシステムから推定された結果との相関が見られた。これらの結果から本検査法はBSL-2における簡便なHIV薬剤感受性検査として有用であると考えられた。効率よく運用できる様に今後システムに更なる改良を加えていきたい。

Research Products

• [Journal Article] Levels of serum HIV-1 RNA viral load in tuberculosis patients with or without intestinal parasites during treatment of tuberculosis in Gondar (2008)
  • Author(s): Kassu A, Fujino M, Nishizawa M, Mengistu G, Diro E, Ayele B, Ketema D, Moges F, Mulu F, Yismaw G, Huruy K, Abate E, Getachew A, Tiruneh M, Wondmikum Y, Sugiura W, Ota F
  • Journal Title: Ethiopia Ethiop. J. Health Biomed Sci. 1(1) Pages: 3-10
• [Journal Article] Lysophosphatidylcholine upregulates LOX-1, chemokine receptors, and activation-related transcription factors in human T-cell line Jurkat. (2008)
  • Author(s): Hara Y, Kusumi Y, Mitsumata M, Li XK, Fujino M.
  • Journal Title: J Thromb Thrombolysis. 26(2) Pages: 113-8
• [Journal Article] Lysophosphatidylcholine upregulates LOX-1, chemokine receptors, and activation-related transcription factors in human T-cell line Jurkat. (2008)
  • Author(s): Hara Y, Kusumi Y, Mitsumata M, Li XK, Fujino M.
  • Journal Title: J Thromb Thrombolysis. Oct;26(2) Pages: 113-8
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Levels of serum HIV-1 RNA viral load in tuberculosis patients with or without intestinal parasites during treatment of tuberculosis in Gondar, Ethiopia (2008)
  • Author(s): Kassu A, Fujino M, Nishizawa M, Mengistu G, Diro E, Ayele B, Ketema D, Moges F, Mulu F, Yismaw G, Huruy K, Abate E, Getachew A, Tiruneh M, Wondmikum Y, Sugiura W, Ota F
  • Journal Title: Ethiop. J. Health Biomed Sci. Sep;1(1) Pages: 3-10
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Effects of Protease and reverse transcriptase inhibitor-resistance mutations on integrase polymorphism in multidrug resistance cases (2007)
  • Author(s): Suzuki H, Fujino M, Matsuda M, Yan H, Iwatani Y, Sugiura W.
  • Journal Title: Antivir Ther. 12(1)
• [Journal Article] Interference between Gag non-cleavage site mutation P453L aned HIV-1 protease non-drug resistance mutation E35D. (2007)
  • Author(s): Shibata J, Ren F, Nishizawa M, Fujino M, Iwatani Y, Matsuda M, Miura H, Tanaka, Sugiura W.
  • Journal Title: Antivir Ther 12(1)
• [Journal Article] Molecular Epidemiology of HIV-1 in Treatment-Naive Patients in North Ethiopia (2007)
  • Author(s): Kassu A, Fujino M, Matsuda M, Nishizawa M, Ota F, Sugiura W
  • Journal Title: AIDS Res Hum Retroviruses. 23(4) Pages: 564-8
• [Presentation] HIV薬剤耐性検査標準化のための検討 (2008)
  • Author(s): 吉田繁、藤崎誠一郎、服部純子、伊部史朗、藤野真之、松田昌和、和山行正、岡田清美、藤崎彩恵子、巽正志、金田次弘、杉浦亙
  • Organizer: 第55回日本臨床検査医学会学術集
  • Place of Presentation: 名古屋
• [Presentation] 2003-2007年の新規HIV-1感染者における薬剤耐性頻度の動向 (2008)
  • Author(s): 杉浦亙、潟永博之、吉田繁、千葉仁志、小池隆夫、伊藤俊広、原孝、佐藤武幸、石ヶ坪良明、上田敦久、近藤真規子、今井光信、貞升健志、長島真美、福武勝幸、山元泰之、田中理恵、加藤信吾、宮崎菜穂子、藤井毅、岩本愛吉、藤野真之、仲宗根正、巽正志、椎野禎一郎、岡慎一、林田庸総、服部純子、伊部史朗、藤崎誠一郎、金田次弘、浜口元洋、上田幹夫、大家正義、田邊嘉也、渡辺香奈子、渡邊大、白阪琢磨、桑原健、森治代、小島洋子、高田昇、木村昭郎、南留美、山本政弘、松下修三、健山正男、藤田次郎
  • Organizer: 第22回日本エイズ学会学術集会・総会
  • Place of Presentation: 大阪
• [Presentation] HIV薬剤耐性検査標準化のための検討 (2008)
  • Author(s): 吉田繁, 藤崎誠一郎, 服部純子, 伊部史朗, 藤野真之, 松田昌和, 和山行正, 岡田清美, 藤崎彩恵子, 巽正志, 金田次弘, 杉浦亙
  • Organizer: 第55回日本臨床検査医学会学術集会
  • Place of Presentation: 名古屋
• [Presentation] ロテアーゼ阻害剤耐性HlV-1株に対するダルナビルの有効性についての解析 (2007)
  • Author(s): 藤野 真之、三浦 秀佳、西澤 雅子、松田 昌和、鈴木 寿子、杉浦 亙
  • Organizer: 第21回日本エイズ学会学術集会・総会
  • Place of Presentation: 広島
  • Year and Date: 2007-11-30
• [Presentation] 抗HIV薬剤投与下におけるProteaseとGagの相互干渉と共進化に関する解析 (2007)
  • Author(s): 柴田潤子、任鳳蓉、西澤雅子、藤野真之、松田昌和、岩谷靖雅、杉浦亙、田中博
  • Organizer: 第55回日本ウイルス学会学術集会
  • Place of Presentation: 札幌
• [Presentation] HIV-1のenv遺伝子における多様性進化 (2007)
  • Author(s): 吉田いづみ、西澤雅子、藤野真之、仲宗根正、岩谷靖雅、長谷川直紀、柴田潤子、杉浦亙、任鳳蓉、田中博
  • Organizer: 第55回日本ウイルス学会学術集会
  • Place of Presentation: 札幌
• [Presentation] プロテア-ゼ阻害剤耐性HIV-1株に対するダルナビルの有効性についての解析 (2007)
  • Author(s): 藤野真之、三浦秀佳、西澤雅子、松田昌和、鈴木寿子、杉浦亙
  • Organizer: 第21回日本エイズ学会学術集会・総会
  • Place of Presentation: 広島
• [Presentation] 多剤併用療法がインテグラ-ゼの多様性に及ぼす影響について (2007)
  • Author(s): 鈴木寿子、厳馬華、松田昌和、藤野真之、西澤雅子、岩谷靖雅、杉浦亙
  • Organizer: 第21回日本エイズ学会学術集会・総
  • Place of Presentation: 広島
• [Presentation] 抗HIV薬剤投与下におけるProteaseとGagの共進化に関する解析 (2007)
  • Author(s): 柴田潤子、任鳳蓉、西澤雅子、藤野真之、松田昌和、岩谷靖雅、杉浦亙、田中博
  • Organizer: 第21回日本エイズ学会学術集会・総会
  • Place of Presentation: 広島
• [Presentation] HIV-1 env遺伝子の多様性進化 (2007)
  • Author(s): 吉田いづみ、西澤雅子、藤野真之、仲宗根正、岩谷靖雅、長谷川直紀、柴田潤子、杉浦亙、任鳳蓉、田中博
  • Organizer: 第21回日本エイズ学会学術集会・総会
  • Place of Presentation: 広島
• [Presentation] 2003-2006年の新規HIV-1感染者における薬剤耐性頻度の動向 (2007)
  • Author(s): 杉浦亙、潟永博之、吉田繁、千葉仁志、小池隆夫、伊藤俊広、原孝、佐藤武幸、石ヶ坪良明、上田敦久、近藤真規子、今井光信、貞升健志、長島真美、福武勝幸、山元泰之、田中理恵、加藤信吾、宮崎菜穂子、岩本愛吉、藤野真之、仲宗根正、巽正志、椎野禎一郎、岡慎一、林田庸総、服部純子、伊部史朗、藤崎誠一郎、金田次弘、浜口元洋、上田幹夫、正兼亜季、大家正義、下条文武、田邊嘉也、渡辺香奈子、白阪琢磨、桑原健、森治代、小島洋子、中桐逸博、高田昇、木村昭郎、南留美、山本政弘、松下修三、健山正男、藤田次郎
  • Organizer: 第21回日本エイズ学会学術集会・総会
  • Place of Presentation: 広島