PS-tagを用いるOne-stepタンパク質間相互作用検出システムの開発

Research Project

Project/Area Number	19860042
Research Category	Grant-in-Aid for Young Scientists (Start-up)
Allocation Type	Single-year Grants
Research Field	Biofunction/Bioprocess
Research Institution	Kyoto Institute of Technology
Principal Investigator	熊田陽一京都工繊大, 助教 (70452373)
Project Period (FY)	2007 – 2008
Project Status	Completed (Fiscal Year 2008)
Budget Amount *help	¥3,095,000 (Direct Cost: ¥2,690,000、Indirect Cost: ¥405,000) Fiscal Year 2008: ¥1,755,000 (Direct Cost: ¥1,350,000、Indirect Cost: ¥405,000) Fiscal Year 2007: ¥1,340,000 (Direct Cost: ¥1,340,000)
Keywords	Polystyrene binding peptide / polystyrene / protein immobilization / hydrophilic polystyrene plate / cysteine synthase complex
Research Abstract	本研究課題では、プロテオーム解析におけるタンパク質の機能解析の支援技術として、独自に開発したポリスチレン親和性ペプチド(PS-tag)を利用した迅速かつ高感度なタンパク質問相互作用検出システムを開発することを目的とした。リガンドタンパク質であるOASSのC末端にPS-tagを遺伝子融合したOASS-C-PS-tagを組換え大腸菌にて発現し、野生型OASSと同様な方法で精製した。また、野生型OASSの表面にPS-tagを2価性架橋剤によってランダムに標識したOASS-R-PS-tagを調製した。3種類のリガンドタンパク質のPSプレートへの固定化量、配向性、および安定性を比較した。ところ、PS-tagを融合または標識されたOASS-C-PS-tagおよびOASS-R-PS-tagは親水性PS plate上に安定かつ高密度に固定化できることが明らかとなった。さらに、Serine Acetyltransferase(SAT)との相互作用を検出したところ、OASS-C-PS-tagおよびOASS-R-PS-tagを固定化したPS plateから強いシグナルが得られた。したがって、PS-tagをリガンドタンパク質に融合または標識することでタンパク質間相互作用をin vitroで高感度に検出できることが明らかとなった。