Structural basis of reaction mechanism and proton pathway of [NiFe]-hydrogenase

• Project/Area Number: 19H00984
• Research Category: Grant-in-Aid for Scientific Research (A)
• Allocation Type: Single-year Grants
• Section: 一般
• Review Section: Medium-sized Section 43:Biology at molecular to cellular levels, and related fields
• Research Institution: University of Hyogo
• Principal Investigator: 樋口 芳樹 兵庫県立大学, 理学研究科, 特任教授 (90183574)
• Project Period (FY): 2019-04-01 – 2024-03-31
• Project Status: Granted (Fiscal Year 2023)
• Budget Amount: ¥45,370,000 (Direct Cost: ¥34,900,000、Indirect Cost: ¥10,470,000); Fiscal Year 2023: ¥7,930,000 (Direct Cost: ¥6,100,000、Indirect Cost: ¥1,830,000); Fiscal Year 2022: ¥7,930,000 (Direct Cost: ¥6,100,000、Indirect Cost: ¥1,830,000); Fiscal Year 2021: ¥7,670,000 (Direct Cost: ¥5,900,000、Indirect Cost: ¥1,770,000); Fiscal Year 2020: ¥7,670,000 (Direct Cost: ¥5,900,000、Indirect Cost: ¥1,770,000); Fiscal Year 2019: ¥14,170,000 (Direct Cost: ¥10,900,000、Indirect Cost: ¥3,270,000)
• Keywords: ヒドロゲナーゼ / プロトン経路 / X線結晶解析 / 中性子結晶解析 / 酸素耐性機構 / ラマン分光法 / 酵素活性定量法 / 酸素耐性酵素 / 活性測定法

Outline of Research at the Start

本研究では，下記の研究を行う．
（１）標準的[NiFe]ヒドロゲナーゼの中性子結晶解析で得られる核密度分布より，Ni－Fe活性部位における触媒反応のヒドリド結合中間体構造とプロトン経路を完全同定し，反応機構とそれを高効率化しているタンパク質内のプロトン機能「場」の役割を明らかにする．
（２）種々の酸素耐性ヒドロゲナーゼの高精度X線結晶解析を基に，酸素耐性機構の一般則を提案する．
（３）ラマン分光法による新規の触媒活性定量法を開発し，ヒドロゲナーゼ等ガス状分子を基質とするタンパク質機能の本質に迫る．

Outline of Annual Research Achievements

（1）ヒドロゲナーゼの中性子結晶構造解析：2020年度末に試料調製のための嫌気グローブボックスが故障したが，コロナ禍の影響で部品調達が遅れ，修理が2021年度の夏に完了した．日本原子力開発研究機構・大強度陽子加速器施設（J-PARC）における中性子結晶回折実験のビームタイムの日程に結晶調製を合わすことができず，今年度の回折実験は実施できなかった．一方，昨年見出した「酸化型酵素結晶中のNi-Fe活性部位の構造が歪んでいる分子」について高分解能X線結晶解析による精密化を進展させた．得られたX線構造解析結果は中性子結晶構造解析結果とも矛盾しないことを確認し，現在論文発表準備中である．
（2）ヒドロゲナーゼの酸素耐性機構・一般則の確立（分子内の水分子の役割解明）：　新規の酸素耐性酵素である，Citrobacter由来[NiFe]ヒドロゲナーゼに競争阻害剤である一酸化炭素（CO）を結合させてX線結晶構造解析を実施した．本結晶解析の結果，酸素耐性とCO耐性には正の相関があることを初めて明らかにして国際結晶学連合の学術誌に発表した．　NAD+還元ヒドロゲナーゼは，Ni-Fe活性部位自体が酸素による修飾を防御する分子機構を備えている．このNAD+還元ヒドロゲナーゼの酸化型結晶についてFT-IRによる構造解析を進展させた．
（3）ラマン分光法による触媒活性定量法の開発：　昨年までの研究により，酵素と基質（気体水素）の反応は，主に酵素溶液相と気相との界面で起こっていることを見出していた．そこで，本年度は，酵素溶液をエアロゾルにして気相中に浮遊させて酵素触媒反応が測定可能であることを実証した．

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

昨年度に引き続き，コロナ禍の影響で水素還元型[NiFe]ヒドロゲナーゼの中性子結晶構造解析は進展していないが，酸化型酵素の結晶中に見出した「Ni-Fe活性部位の構造が歪んでいる分子」の精密構造を高分解能X線結晶解析で明らかにすることに成功し，またその結果が中性子結晶解析結果と矛盾しないことを確認した．現在，得られた結果を論文発表準備中である．
また，Citrobacter由来[NiFe]ヒドロゲナーゼについて，水素の競争阻害剤である一酸化炭素（CO）を結合させてX線結晶構造解析することに成功し，酸素耐性とCO耐性に正の相関があることを見出した．
ラマン分光法による触媒活性定量法の開発では，酵素溶液をエアロゾルにしても触媒活性が測定可能であることを初めて実証した．

Strategy for Future Research Activity

（1）[NiFe]ヒドロゲナーゼの高分解能中性子結晶構造化学
酵素分子のプロトン経路をH+（またはD+）でラベルした結晶について，高分解能の中性子回折全データの取得を試みる．中性子回折データの取得に成功した場合，同じ結晶からSPring-8にて超高分解能のX線回折データを収集し，中性子およびX線回折データの両方を用いて構造精密化を行い，最終的にプロトン経路を同定する．
（2）ヒドロゲナーゼの酸素耐性機構・一般則の確立（分子内の水分子の役割解明）
COが活性阻害を起こす場合，Ni-Fe活性部位最近傍の[4Fe-4S]-4Cysの構造変化に対する影響をさらに詳細に検証する．また，酸素感受性の高い標準的酵素に酸素耐性を付与した変異体や酸素耐性酵素からその機能を削除した変異体酵素を調製するための発現系の構築を進める．一方，NAD+還元ヒドロゲナーゼは，Ni-Fe活性部位自体が酸素による修飾を防御する機構や活性酸素種の生成を抑える分子機構を備えている．このNAD+還元ヒドロゲナーゼについて，2021年度に引き続き結晶FT-IRの測定を続ける．
（3）ラマン分光法による触媒活性定量法の開発
再現性の高いラマン散乱データを得るために改良した酵素反応セルを用いて本測定方法を確立するとともに，酵素溶液をエアロゾルにした試料を用いて酵素活性を高精度に定量できるか調査する．

Research Products

• [Int'l Joint Research] Technische Universitat Berlin(ドイツ)
• [Journal Article] Rational design of metal-binding sites in domain-swapped myoglobin dimers (2021)
  • Author(s): Nagao Satoshi、Idomoto Ayaka、Shibata Naoki、Higuchi Yoshiki、Hirota Shun
  • Journal Title: Journal of Inorganic Biochemistry Volume: 217 Pages: 111374-111374
  • DOI: 10.1016/j.jinorgbio.2021.111374
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] The Challenge of Visualizing the Bridging Hydride at the Active Site and Proton Network of [NiFe]-Hydrogenase by Neutron Crystallography (2021)
  • Author(s): Hiromoto Takeshi、Nishikawa Koji、Tamada Taro、Higuchi Yoshiki
  • Journal Title: Topics in Catalysis Volume: - Issue: 9-12 Pages: 622-630
  • DOI: 10.1007/s11244-021-01417-0
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Experimental and theoretical study on converting myoglobin into a stable domain-swapped dimer by utilizing a tight hydrogen bond network at the hinge region (2021)
  • Author(s): Xie Cheng、Shimoyama Hiromitsu、Yamanaka Masaru、Nagao Satoshi、Komori Hirofumi、Shibata Naoki、Higuchi Yoshiki、Shigeta Yasuteru、Hirota Shun
  • Journal Title: RSC Advances Volume: 11 Issue: 59 Pages: 37604-37611
  • DOI: 10.1039/d1ra06888a
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] 3D Domain Swapping of Azurin from Alcaligenes xylosoxidans (2020)
  • Author(s): Robby Noor Cahyono, Masaru Yamanaka, Satoshi Nagao, Naoki Shibata, Yoshiki Higuchi, Shun Hirota
  • Journal Title: Metallomics Volume: 12 Issue: 3 Pages: 337-345
  • DOI: 10.1039/c9mt00255c
  • Peer Reviewed / Int'l Joint Research
• [Journal Article] Thermodynamic Control of Domain Swapping by Modulating the Helical Propensity in the Hinge Region of Myoglobin (2020)
  • Author(s): Nagao Satoshi、Suda Ayaka、Kobayashi Hisashi、Shibata Naoki、Higuchi Yoshiki、Hirota Shun
  • Journal Title: Chemistry - An Asian Journal Volume: 15 Issue: 11 Pages: 1743-1749
  • DOI: 10.1002/asia.202000307
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Towards cryogenic neutron crystallography on the reduced form of [NiFe]-hydrogenase (2020)
  • Author(s): Hiromoto Takeshi、Nishikawa Koji、Inoue Seiya、Matsuura Hiroaki、Hirano Yu、Kurihara Kazuo、Kusaka Katsuhiro、Cuneo Matthew、Coates Leighton、Tamada Taro、Higuchi Yoshiki
  • Journal Title: Acta Crystallographica Section D Structural Biology Volume: 76 Issue: 10 Pages: 946-953
  • DOI: 10.1107/s2059798320011365
  • Peer Reviewed / Int'l Joint Research
• [Journal Article] X 線結晶構造に基づくB12 補酵素がラジカル酵素反応を制御する仕組みの解明 (2020)
  • Author(s): 柴田直樹，末吉由依，樋口芳樹，虎谷哲夫
  • Journal Title: 放射光 Volume: 33 Pages: 33-42
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] 生物のエネルギー代謝酵素の分子進化 (2020)
  • Author(s): 樋口芳樹
  • Journal Title: 実験医学増刊 イメージング時代の構造生命科学 Volume: 38 Pages: 56-59
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Cysteine SH and glutamate COOH contributions to [NiFe] hydrogenase proton transfer revealed by highly sensitive FT-IR spectroscopy (2019)
  • Author(s): H. Tai, K. Nishikawa, Y. Higuchi, Z-w. Mao and S. Hirota
  • Journal Title: Angew. Chem. Int. Ed. Volume: 58 Issue: 38 Pages: 13285-13290
  • DOI: 10.1002/anie.201904472
  • NAID: 120006725011
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Structural Basis of the Function of [NiFe]-hydrogenases (2019)
  • Author(s): K. Nishikawa, H. Ogata and Y. Higuchi
  • Journal Title: Chemistry Letters Volume: 49 Issue: 2 Pages: 164-173
  • DOI: 10.1246/cl.190814
  • NAID: 130007795076
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] NAD+-reducing [NiFe]-hydrogenase (2019)
  • Author(s): Y. Shomura and Y. Higuchi
  • Journal Title: Encyclopedia of Inorganic and Bioinorganic Chemistry Volume: 1 Pages: 1-11
  • DOI: 10.1002/9781119951438.eibc2697
  • Peer Reviewed
• [Presentation] Experimental and theoretical study on converting myoglobin into a stable domain-swapped dimer by utilizing a tight hydrogen bond network at the hinge region (2022)
  • Author(s): ○Hiromitsu Shimoyama, Masaru Yamanaka, Satoshi Nagao, Hirofumi Komori,3Naoki Shibata, Yoshiki Higuchi, Yasuteru Shigeta, and Shun Hirota
  • Organizer: 日本化学会第102春季年会
• [Presentation] [NiFe]ヒドロゲナーゼの分子機能の構造基盤 (2021)
  • Author(s): 樋口芳樹
  • Organizer: CBI学会2021年大会
  • Invited
• [Presentation] 水素発生分解酵素・ヒドロゲナーゼの構造生物学 (2021)
  • Author(s): 樋口芳樹
  • Organizer: バイオインダストリー協会 発酵と代謝研究会 第２回勉強会
  • Invited
• [Presentation] ヒドロゲナーゼによる水素合成・分解についての構造化学 (2021)
  • Author(s): 樋口芳樹
  • Organizer: ポリマーフロンティア21
  • Invited
• [Presentation] ヒドロゲナーゼによる水素合成・分解についての構造化学 (2021)
  • Author(s): 樋口芳樹
  • Organizer: 兵庫県立大学・水素エネルギー共同研究センター研究発表
  • Invited
• [Presentation] ラジカルB12酵素ジオールデヒドラターゼ―アデノシルメチルコバラミン複合体の立体構造 (2021)
  • Author(s): ○柴田 直樹，樋口 芳樹，虎谷 哲夫
  • Organizer: 第463回ビタミンB研究協議会
  • Invited
• [Presentation] New assay method for the enzymatic reaction with gaseous substrates by RAMAN spectroscopy (2021)
  • Author(s): ○Koji Nishikawa, Yuka Nakagawa, Shota Inoue, Takfumi Chuji, Satoshi Nakashima, Yasuteru Shigeta, Katsuyuki Fukutani and Yoshiki Higuchi
  • Organizer: Material Research Meeting 2021
  • Int'l Joint Research / Invited
• [Presentation] Neutron diffraction studies of [NiFe]-hydrogenase from Desulfovibrio vulgaris Miyazaki F (2020)
  • Author(s): T. Tamada, T. Hiromoto, K. Nishikawa, Y. Hirano, K. Kusaka, L. Coates, Y. Higuchi
  • Organizer: 第20回日本蛋白質科学会年会
• [Presentation] プレートスキャン法を用いた[NiFe]ヒドロゲナーゼの常温構造解析 (2020)
  • Author(s): 今西隆浩，熊坂崇，奥村英夫，仲村勇樹，松浦滉明，樋口芳樹
  • Organizer: 日本結晶学会2020年度年会
• [Presentation] 生物酵素による水素の合成と分解～水素触媒の新たな展開になるか～ (2020)
  • Author(s): 樋口芳樹
  • Organizer: 若狭湾エネルギー研究所・先端技術セミナー
• [Presentation] NEW ASSAY METHOD FOR THE ENZYMES REACTING WITH GASEOUS SUBSTRATES BY RAMAN SPECTROSCOPY (2020)
  • Author(s): K. Nishikawa, Y. Kawahara, S. Inoue, T. Chuji, S. Nakashima, Y. Shigeta, K. Fukutani and Y. Higuchi
  • Organizer: 1st INTERNATIONAL SYMPOSIUM “HYDROGENOMICS” combined with 14th INTERNATIONAL SYMPOSIUM HYDROGEN & ENERGY
  • Int'l Joint Research
• [Presentation] THEORETICAL ANALYSIS ON STRUCTURES OF RESTING OXIDIZED STATES OF [NIFE]HYDROGENASE (2020)
  • Author(s): K. Ishikawa, M. Shoji, Y. Hori, T. Hiromoto, Y. Higuchi, and Y. Shigeta
  • Organizer: 1st INTERNATIONAL SYMPOSIUM “HYDROGENOMICS” combined with 14th INTERNATIONAL SYMPOSIUM HYDROGEN & ENERGY
  • Int'l Joint Research
• [Presentation] Neutron diffraction studies of [NiFe] hydrogenase from Desulfovibrio vulgaris Miyazaki (2019)
  • Author(s): T. Tamada, T. Hiromoto, K. Nishikawa, K. Kurihara, Y. Hirano, Y. Higuchi
  • Organizer: 12th International Conference on Hydrogenases
  • Int'l Joint Research
• [Presentation] Role of water network for O2-stability of [NiFe]-hydrogenases (2019)
  • Author(s): Y. Higuchi
  • Organizer: 12th International Conference on Hydrogenases
  • Int'l Joint Research / Invited
• [Presentation] Structural Studies on [NiFe]-hydrogenases-Role of water/proton-network for O2-stability (2019)
  • Author(s): Y. Higuchi
  • Organizer: I2CNER International Workshop
  • Int'l Joint Research / Invited
• [Presentation] 生物酵素・ヒドロゲナーゼにおける水素合成・活性化触媒反応機構の構造化学 (2019)
  • Author(s): 樋口芳樹
  • Organizer: 第16回Cat-CVD研究会
  • Invited
• [Presentation] Neutron diffraction experiments on [NiFe]-hydrogenase reduced under H2 atmosphere (2019)
  • Author(s): T. Hiromoto, K. Nishikawa, H. Matsuura, Y. Hirano, K. Kusaka, M. Cuneo, T. Tamada, Y. Higuchi
  • Organizer: The 6th International Symposium on Diffraction Structural Biology 2019
  • Int'l Joint Research
• [Presentation] Expression, purification and crystallization of HybA in Hyb-type [NiFe]-hydrogenase (2019)
  • Author(s): T. Imanishi, H. Matsuura, H. Hasuike, T. Hiromoto, Y. Higuchi
  • Organizer: The 6th International Symposium on Diffraction Structural Biology 2019
  • Int'l Joint Research
• [Presentation] STRUCTURAL STUDIES ON [NiFe]-HYDROGENASES (2019)
  • Author(s): Y. Higuchi
  • Organizer: 3rd International Solar Fuels Conference/International Conference on Artificial Photosynthesis-2019
  • Int'l Joint Research / Invited
• [Presentation] [NiFe]ヒドロゲナーゼ近位[FeS]クラスターの酸化による構造変化 (2019)
  • Author(s): 井上翔太、西川幸志 樋口芳樹
  • Organizer: 日本結晶学会2019年度年会
• [Presentation] Desulfovibrio vulgaris Miyazaki F株由来[NiFe]ヒドロゲナーゼの中性子回折実験 (2019)
  • Author(s): 玉田 太郎、廣本 武史、西川 幸志、井上 誠也、平野 優、樋口 芳樹
  • Organizer: 日本結晶学会2019年度年会
• [Presentation] Desulfovibrio vulgaris Miyazaki F株由来[NiFe]-ヒドロゲナーゼの中性子回折実験 (2019)
  • Author(s): 玉田太郎、廣本武史、西川幸志、井上誠也、平野優、樋口芳樹
  • Organizer: 第19回日本蛋白質科学会年会 第71回日本細胞生物学会大会 合同年次大会
• [Book] 生命金属ダイナミクス（水素酸化還元酵素ヒドロゲナーゼ） (2021)
  • Author(s): 樋口芳樹（城宜嗣・津本浩平 監修）
  • Total Pages: 564
  • Publisher: （株）エヌ・ティー・エス
  • ISBN: 9784860437060