| Project/Area Number |
19H01022
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| Research Category |
Grant-in-Aid for Scientific Research (A)
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| Allocation Type | Single-year Grants |
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| Section | 一般 |
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| Review Section |
Medium-sized Section 48:Biomedical structure and function and related fields
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| Research Institution | National Cardiovascular Center Research Institute |
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Principal Investigator |
望月 直樹 国立研究開発法人国立循環器病研究センター, 研究所, 研究所長 (30311426)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
中嶋 洋行 国立研究開発法人国立循環器病研究センター, 研究所, 室長 (10467657)
迫 圭輔 国立研究開発法人国立循環器病研究センター, 研究所, 上級研究員 (50786291)
福井 一 国立研究開発法人国立循環器病研究センター, 研究所, 室長 (80551506)
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| Project Period (FY) |
2019-04-01 – 2024-03-31
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| Project Status |
Granted (Fiscal Year 2023)
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| Budget Amount *help |
¥45,110,000 (Direct Cost: ¥34,700,000、Indirect Cost: ¥10,410,000)
Fiscal Year 2023: ¥8,840,000 (Direct Cost: ¥6,800,000、Indirect Cost: ¥2,040,000)
Fiscal Year 2022: ¥8,840,000 (Direct Cost: ¥6,800,000、Indirect Cost: ¥2,040,000)
Fiscal Year 2021: ¥8,840,000 (Direct Cost: ¥6,800,000、Indirect Cost: ¥2,040,000)
Fiscal Year 2020: ¥8,840,000 (Direct Cost: ¥6,800,000、Indirect Cost: ¥2,040,000)
Fiscal Year 2019: ¥9,750,000 (Direct Cost: ¥7,500,000、Indirect Cost: ¥2,250,000)
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| Keywords | 左右軸 / クッパ―胞 / 繊毛 / 中胚葉 / ゼブラフィッシュ / 左右非対称性 / 情報伝達系 / 左右非対称 / 発生 / イメージング / 側板中胚葉 / 内胚葉 / 器官形成 |
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| Outline of Research at the Start |
生体の軸形成（前後、背腹、左右）の中で臓器配置の左右非対称性のメカニズムの解明を目的とする。これまでに、左右決定器官としての哺乳類のNode・魚類のKupffer’s vesicle (KV)の繊毛の回転（流れ）とNodeシグナルの重要性が明らかとなっている。しかし、これらは遺伝子破壊による分子の要求性を調べた研究が主であり、どのような分子がどこで機能するか？あるいは、解剖学的にどのような細胞の配置やシグナルの活性化が左右非対称性となるかについては、明確にされていない。本研究では、これまで解明されてきた左右非対称性のシグナルに不可欠な分子が如何なるメカニズムで左右決定に関わるかを明らかにする。
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| Outline of Annual Research Achievements |
従来の左右決定器官としてのノード結節 (ゼブラフィッシュKupffer's vesicle(KV)) 依存性の左右決定機構つまり、ＫＶの繊毛回転非依存性の左右決定機構について研究を行っている。KV胞の形成前からのKV構成内胚葉細胞(sox17) 陽性細胞のCa2+シグナルには大きな左右差がないことを確認できた。このために、Nodalシグナル以外のNotch、FGFシグナルによる胚体の左右差も検討したが、晃かな左右差は認めなかった。これまで、Spawの遺伝子発現がRostoral側から開始されることもある個体を発見したために、Dorsal forrunner cell (DFC)の重要性を検討してきたが、再度Spawの発現を検討したところ、KV周囲からはじまり、前方にSpawの発現が広がることが明らかになった。これは、タイムラプス顕微鏡を用いて、側方と背側から繰り返して観察することにより明らかにすることができた。本結果は、従来の繊毛依存性の左右差形成を裏付けることになったので、Dand5の遺伝子発現と局在を生体内で調べるために、Dand5-EGFPのノックイン個体の作製を開始した。さらに、Spawもこれまでは、プロモーター依存性の転写モニターリング個体のみを観察していたが、Spaw-EGFPをノックインして融合タンパク質を発現することにより、胚体内でどこまで、Spawが分泌・到達するかを可視化できる個体を作製中である。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
ゼブラフィッシュはＫＶ内の繊毛回転により、非回転繊毛の流れ感知機構により、Ca2+シグナルが側方に広がることで、Nodalシグナルが伝搬していくと考えられる。われわれもこの結果に矛盾しない結果を得ているが、これまでにSpawがどこまで生体内で到達しているかは明らかではないし、Spawの遺伝子発現が左側のみでみられることから左右決定に重要であることの証明とされてきた。Spawが正中線を越えて、右側に到達するのか？それともLeftyによるシグナルで相殺されるのか？など未だに不明な点が多いために、Spaw, Dand5の分泌部位と分泌されてから、成体内でどこまで到達できるのを調べることは、意味のあることと考えて研究を展開している。この点は、ＫＶ依存性つまり繊毛回転依存性の左右差決定機構として考えられるが、ブタではノードの繊毛が存在しないために、繊毛非依存性の左右差決定機構が存在することは、明らかである。
この繊毛非依存性の左右決定機構を明らかにするために、成体で左右差を有して発現する遺伝子発現を京都大学の沖博士に指導を受けながら、Photo-Isolation Chemistry 手法で確認できないかに挑戦している。胚体の左と右で発現する遺伝子の相違をみることができれば、左右差を決定する因子の上流を探索することが可能であり、ＫＶ胞の形成前の組織での左右差決定因子を同定できる可能性を想定して、研究を進めている。
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| Strategy for Future Research Activity |
Nodalシグナルが規定する左右差（繊毛回転依存性）と繊毛非依存性の左右差の決定機構を明らかにすることに注力する。特に前者は、Spaw-EGFP, Dand5-EGFP, Lefty-EGFPのノックイン個体を作製することで詳細が検討できると考える。また、ＫＶ形成前の左右差決定の可能性についても、 Photo-Isolation Chemistryで左右の発現遺伝子の差を突き止めることが可能である。同定した遺伝子は、ノックアウト個体を作製して、心臓の位置を検討できるTg(myl7:mCherry) 個体でのノックアウトで左右差形成への影響を判断できる。
また、これらの早期左右差遺伝子発現がＫＶの形成には影響ないことは、KVの繊毛形成や回転を可視化できるArl13b:EGFP個体でのノックアウト個体やTg(sox17:EGFP) 個体でのKV形成と繊毛形成の可視化により、純粋に繊毛非依存性の影響か否かを調べることができると考える。
以上の繊毛非依存性、繊毛依存性の両者により左右差を形成して、臓器の位置を確定するための発生段階での調節機構の全貌を解明できると考える。
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