Generation of highly functionalized naphthoquiones based on the mechanistic understanding of biosynthetic enzymes

• Project/Area Number: 19H03385
• Research Category: Grant-in-Aid for Scientific Research (B)
• Allocation Type: Single-year Grants
• Section: 一般
• Review Section: Basic Section 47050:Environmental and natural pharmaceutical resources-related
• Research Institution: Musashino University
• Principal Investigator: 市瀬 浩志 武蔵野大学, 薬学部, 教授 (40282610)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 石川 和樹 武蔵野大学, 薬学部, 助教 (30779822) ; 熊本 卓哉 広島大学, 医系科学研究科(薬), 教授 (50292678) ; 橋元 誠 武蔵野大学, 薬学部, 講師 (80552893)
• Project Period (FY): 2019-04-01 – 2024-03-31
• Project Status: Completed (Fiscal Year 2023)
• Budget Amount: ¥17,420,000 (Direct Cost: ¥13,400,000、Indirect Cost: ¥4,020,000); Fiscal Year 2023: ¥2,340,000 (Direct Cost: ¥1,800,000、Indirect Cost: ¥540,000); Fiscal Year 2022: ¥1,820,000 (Direct Cost: ¥1,400,000、Indirect Cost: ¥420,000); Fiscal Year 2021: ¥2,470,000 (Direct Cost: ¥1,900,000、Indirect Cost: ¥570,000); Fiscal Year 2020: ¥2,860,000 (Direct Cost: ¥2,200,000、Indirect Cost: ¥660,000); Fiscal Year 2019: ¥7,930,000 (Direct Cost: ¥6,100,000、Indirect Cost: ¥1,830,000)
• Keywords: 生合成 / 二量化 / モデリング / ナフトキノン / 放線菌 / 二次代謝 / 官能基化 / 過酸化水素 / 酸素添加 / エノイル還元 / 立体特異的 / 変異型酵素 / 全合成 / 機能解析 / フラビン / 酵素解析 / 生合成酵素 / 高度官能基化 / 基質認識

Outline of Research at the Start

本研究の概要は、下記の通りである。
酸素添加・多量体化・糖転移などの高度に官能基化されたナフトキノン（NQ）骨格をもつ天然物が、その構造や生物活性の多様性から注目されることを考慮して、NQ骨格をもつ放線菌代謝産物の生合成酵素群の中に①多段階酸素添加と②位置特異的二量化反応を触媒するものを同定したことを機に、各酵素系の基質認識機構の酵素学的解析、各種合成基質に対する酵素反応の精密分析、①②の各類似酵素によるタンパク質工学的な機能開拓を通じて、新たなNQ化合物の創製を行う。学術的特徴として、創製分子に期待される構造と生物活性の多様性と対象酵素群のタンパク質構造としての独自性が特筆される。

Outline of Annual Research Achievements

Streptomyces coelicolor A3(2)の生産するactinorhodin(ACT)は、ナフトキノン(NQ)二量体の基本骨格を有し、Type II 型polyketide synthaseを中核とする単機能酵素群による多段階反応の中に、連続酸素添加並びに位置特異的二量体化という高度官能基化を伴って生合成される芳香族ポリケタイド化合物である。 ACTならびにNQのC-配糖体構造をもつmedermycin (MED)とgranaticin (GRA)に関与する生合成酵素群を利用して、NQ骨格形成に含まれる高度官能基化機構の統合的解明を基盤として下記の6つの目的を設定して研究を展開している。 1.フラビン依存型酸素添加酵素（FMO）ActVA-5/ActVBと類縁酵素の機能解析; 2.改変型FMO酵素群の設計・調製と二量体化酵素ActVA-4/ActVA-3の機能解析; 3.天然型および改変型各種FMOによる各種多環性基質への酸素添加システム構築; 4.ActVA-4/ActVA-3による各種NQ型基質による多量体化反応の試行; 5.AcVA-4/ActVA-3類縁酵素によるNQ型化合物の多量体化反応の実施; 6.改変型高度官能基化酵素システムの設計・調製と高度官能基化NQ化合物の創成
本年度は、昨年度、ActVA-4/ActVA-3をヘテロ二量化酵素として解明したことを受けて、ACTVA-4の類縁酵素Lom-19を利用して、改変型酵素の設計と機能解析を実施した。モデリング解析から両酵素の活性ポケット付近のアミノ酸残基の改変、キメラ作成等を行い、ActVA-4型酵素への変換を試みたが、成功に至っていない。一方、ActVA-3は立体構造のモデリングに成功し、活性発現に重要なアミノ酸を見出した。また、関連のNQ代謝酵素群の機能解析に成功し、学会成果発表を行った。

Research Progress Status

令和5年度が最終年度であるため、記入しない。

Strategy for Future Research Activity

令和5年度が最終年度であるため、記入しない。

Research Products

• [Journal Article] Actinorhodin Biosynthesis Terminates with an Unprecedented Biaryl Coupling Reaction (2022)
  • Author(s): Hashimoto Makoto、Watari Susumu、Taguchi Takaaki、Ishikawa Kazuki、Kumamoto Takuya、Okamoto Susumu、Ichinose Koji
  • Journal Title: Angewandte Chemie International Edition Volume: 62 Issue: 5
  • DOI: 10.1002/anie.202214400
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] Characterization of stereospecific enoyl reductase ActVI-ORF2 for pyran ring formation in the actinorhodin biosynthesis of Streptomyces coelicolor A3(2) (2022)
  • Author(s): Ishikawa Kazuki、Hashimoto Makoto、Komatsu Kunpei、Taguchi Takaaki、Okamoto Susumu、Ichinose Koji
  • Journal Title: Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters Volume: 66 Pages: 128727-128727
  • DOI: 10.1016/j.bmcl.2022.128727
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] Total Synthesis of 6-Deoxydihydrokalafungin, a Key Biosynthetic Precursor of Actinorhodin, and Its Epimer (2021)
  • Author(s): Kumamoto Takuya、Kainuma Mika、Takahashi Azusa、Matsuo Yoshika、Katakawa Kazuaki、Taguchi Takaaki、Ichinose Koji
  • Journal Title: Molecules Volume: 26 Issue: 21 Pages: 6397-6397
  • DOI: 10.3390/molecules26216397
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] Unveiling Two Consecutive Hydroxylations: Mechanisms of Aromatic Hydroxylations Catalyzed by Flavin‐Dependent Monooxygenases for the Biosynthesis of Actinorhodin and Related Antibiotics (2020)
  • Author(s): Hashimoto Makoto、Taguchi Takaaki、Ishikawa Kazuki、Mori Ryuichiro、Hotta Akari、Watari Susumu、Katakawa Kazuaki、Kumamoto Takuya、Okamoto Susumu、Ichinose Koji
  • Journal Title: ChemBioChem Volume: 21 Issue: 5 Pages: 623-627
  • DOI: 10.1002/cbic.201900490
  • Peer Reviewed
• [Presentation] Actinorhodin立体異性体の生産を目指した生合成酵素の in vitro再構成系の応用研究 (2024)
  • Author(s): 矢部成美, 石川和樹, 橋元誠, 市瀬浩志
  • Organizer: 日本薬学会第144年会（横浜） 29P-pm067S
• [Presentation] グナラチシン生合成に関与するラクトン化酵素Gra-18の機能解析 (2024)
  • Author(s): 江原百花, 橋元誠, 新見優太, 亀澤悠香, 石川和樹, 市瀬浩志
  • Organizer: 日本薬学会第144年会（横浜） 29-pm068S
• [Presentation] アクチノロジン生合成に関与する酸化還元酵素ActVI-4の機能解析（第2報） (2024)
  • Author(s): 島津咲梨菜, 橋元誠, 石川和樹, 市瀬浩志
  • Organizer: 日本薬学会第144年会（横浜） 29-pm069S
• [Presentation] Granaticin 生合成の立体化学を制御するケト還元酵素 Gra-6 の機能解析（第２報） (2023)
  • Author(s): 石川和樹, 楠奥紀子, 橋本実里, 野崎千遥, 橋元誠, 市瀬浩志
  • Organizer: 2023年度（第37回）日本放線菌学会大会（広島） P-26
• [Presentation] Actinorhodin 生合成の完全解明：エノイル還元酵素及びアリールカップリング酵素の機能解析 (2023)
  • Author(s): 橋元誠, 石川和樹, 田口貴章, 渡進, 小松薫平, 熊本卓哉, 岡本晋, 市瀬浩志
  • Organizer: 第65回天然有機化合物討論会 (東京）P3-2
• [Presentation] アクチノロジン生合成に関与する酸化還元酵素ActVI-4の機能解析 (2023)
  • Author(s): 福島由梨 , 橋元誠 , 石川和樹 , 市瀬浩志
  • Organizer: 日本薬学会第143年会（札幌）
• [Presentation] Actinorhodins生合成のin vitro再構成に向けた酵素反応条件の最適化（第2報） (2023)
  • Author(s): 塩谷瑠奈 , 石川和樹 , 橋本実里 , 橋元誠 , 田口貴章 , 市瀬浩志
  • Organizer: 日本薬学会第143年会（札幌）
• [Presentation] ベンゾイソクロマンキノン系抗生物質生合成におけるラクトン化に関する酵素学的研究（第２報） (2022)
  • Author(s): 橋元 誠 , 垣敏広 , 石川 和樹 , 田口 貴章 , 市瀬 浩志
  • Organizer: 第36回日本放線菌学会大会（福井）
• [Presentation] 天然物生合成酵素のホモロジーモデリングによる機能解析 (2022)
  • Author(s): 市瀬浩志
  • Organizer: MOEフォーラム 2022
  • Invited
• [Presentation] アクチノロジン生合成における連続水酸化反応機構の解析（第8報） (2021)
  • Author(s): 橋元 誠、高﨑 祐里、石川 和樹、熊本卓哉、 市瀬 浩志
  • Organizer: 第65回日本薬学会 関東支部大会（千葉、オンライン開催）
• [Presentation] ベンゾイソクロマンキノン系抗生物質生合成におけるラクトン化に関する酵素学的研究（第１報） (2021)
  • Author(s): 橋元 誠、 橘 佑夏、 糸賀 真尋、 石川 和樹、 田口 貴章、市瀬 浩志
  • Organizer: 第35回（2021年度）日本放線菌学会大会（神奈川、オンライン開催）
• [Presentation] ベンゾイソクロマンキノン系抗生物質生合成に関与するフラビン依存型酸素添加酵素のホモロジーモデリングによる立構造予測と機能選択性解析(第2報） (2020)
  • Author(s): 高﨑 祐里, 橋元 誠, 渡 進, 網野 祐, 石川 和樹, 市瀬 浩志
  • Organizer: 第64回日本薬学会 関東支部大会（東京、オンライン開催）
• [Presentation] Granaticin生合成の立体化学を制御するケト還元酵素 Gra-6 の機能解析 (2020)
  • Author(s): 橋本 実里, 石川 和樹, 脇田知希, 橋元 誠, 市瀬 浩志
  • Organizer: 第64回日本薬学会 関東支部大会（東京、オンライン開催）
• [Presentation] アクチノロジン生合成におけるアリールカップリング反応機構の解析（第2報） (2020)
  • Author(s): 渡 進, 橋元 誠, 田口 貴章, 石川 和樹, 岡本 晋, 市瀬 浩志
  • Organizer: 第64回日本薬学会 関東支部大会（東京、オンライン開催）
• [Presentation] アクチノロジン生合成におけるアリールカップリング反応機構の解析（第3報） (2020)
  • Author(s): 橋元 誠, 渡 進, 田口 貴章, 石川 和樹, 岡本 晋, 市瀬 浩志
  • Organizer: 第64回日本薬学会 関東支部大会（東京、オンライン開催）
• [Presentation] アクチノロジン生合成におけるアリールカップリング反応機構の解析（第1報） (2020)
  • Author(s): 渡進，橋元誠，田口貴章，石川和樹，岡本晋，市瀬浩志
  • Organizer: 日本薬学会第140回年会（京都）
• [Presentation] アクチノロジン生合成における連続水酸化反応機構の解析（第6報） (2020)
  • Author(s): 網野祐，橋元誠，田口貴章，石川和樹，熊本卓哉，岡本晋，市瀬浩志
  • Organizer: 日本薬学会第140回年会（京都）
• [Presentation] アクチノロジン生合成に関与する二機能性酵素の同定と特性解析 (2019)
  • Author(s): 市瀬浩志，田口貴章，淡川孝義，橋元誠，石川和樹，片川和明，熊本卓哉，大西康夫，岡本晋
  • Organizer: 第61回天然有機化合物討論会（広島）
• [Presentation] ベンゾイソクロマンキノン系抗生物質生合成に関与するフラビン依存型酸素添加酵素のホモロジーモデリングによる立構造予測と機能選択性解析 (2019)
  • Author(s): 渡進，田口貴章，橋元誠，石川和樹，市瀬浩志
  • Organizer: 第63回日本薬学会 関東支部大会（東京）
• [Presentation] アクチノロジン生合成における連続水酸化反応機構の解析（第5報） (2019)
  • Author(s): 橋元誠, 田口貴章，石川和樹，熊本卓哉，岡本晋，市瀬浩志
  • Organizer: 第34回（2019年度）日本放線菌学会大会（札幌）
• [Remarks] 武蔵野大学薬学研究所 生薬化学研究室ホームページ
  • URL: https://www.musashino-u.ac.jp/yakugaku/shoyakukagaku/
• [Remarks] 武蔵野大学薬学部・薬学研究所 生薬化学研究室ホームページ
  • URL: https://www.musashino-u.ac.jp/yakugaku/shoyakukagaku/