| Project/Area Number |
19H05647
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| Research Category |
Grant-in-Aid for Scientific Research (S)
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| Allocation Type | Single-year Grants |
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| Review Section |
Broad Section G
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| Research Institution | Institute of Physical and Chemical Research |
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Principal Investigator |
佐甲 靖志 国立研究開発法人理化学研究所, 開拓研究本部, 主任研究員 (20215700)
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| Project Period (FY) |
2019-06-26 – 2024-03-31
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| Project Status |
Granted (Fiscal Year 2023)
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| Budget Amount *help |
¥153,010,000 (Direct Cost: ¥117,700,000、Indirect Cost: ¥35,310,000)
Fiscal Year 2023: ¥25,480,000 (Direct Cost: ¥19,600,000、Indirect Cost: ¥5,880,000)
Fiscal Year 2022: ¥25,480,000 (Direct Cost: ¥19,600,000、Indirect Cost: ¥5,880,000)
Fiscal Year 2021: ¥30,420,000 (Direct Cost: ¥23,400,000、Indirect Cost: ¥7,020,000)
Fiscal Year 2020: ¥26,520,000 (Direct Cost: ¥20,400,000、Indirect Cost: ¥6,120,000)
Fiscal Year 2019: ¥45,110,000 (Direct Cost: ¥34,700,000、Indirect Cost: ¥10,410,000)
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| Keywords | 受容体 / １分子計測 / 細胞内情報伝達 / 細胞膜 / 1分子計測 |
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| Outline of Research at the Start |
細胞外から内への情報伝達は、さまざまな細胞膜受容体蛋白質によって担われている。膜には数百種類を越える脂質分子種が不均一かつ動的な構造を作って分布し、受容体の機能に影響を与えている。同時に受容体は情報処理反応の進展につれて積極的に周りの脂質環境を変化させているらしい。本研究では様々な受容体と脂質環境の関係を包括的に計測・解析し、受容体と膜の複雑な相互依存的関係を明らかにする。
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究は、最新の１分子計測法などにより、ヒトの主要な膜受容体 (GPCR, RTK) のほぼ全ての分子種について受容体と近傍脂質の自己組織化による機能制御機構を明らかにすることを目的とする。研究は下記４項目とそれらの統合的な解釈で構成される。本年度の研究概要は以下の通りである。
１．膜受容体の細胞膜動態の網羅的な１分子計測:ヒトRTK58種中52種について蛍光蛋白質タグを結合してHEK293細胞に発現させ、リガンドあるいは対照刺激前後の１分子計測を終了した。リガンドが知られていないRTKに関しては対照としてHEK細胞が内在的に発現しているEGFRのリガンド(EGF)を用いた。隠れマルコフモデル解析により、各分子種共通に拡散速度の異なる3状態間の遷移モデルが適用できることが明らかになり、それぞれの分子種について数重の動態パラメータを決定した。今後はこの計測結果に基づく特徴づけを行う。
２．膜脂質と受容体の超解像可視化:RTKの一種EGFRと周辺脂質PIP2, PSの超解像計測を行い、PIP2との共局在がEGF刺激前後で変化すること、さらにPIP2がEGFRの２量体形成とリン酸化を促進し、リン酸化したEGFRはPLCgammaへの情報伝達でPIP2を分解するという自己制御的な受容体周辺脂質の再編成機能を発見した。
３．膜受容体の境界脂質の分析:EGFR周辺脂質の組成変化を生化学的に証明するため、EGFR分子近傍10 nmの細胞膜をSMAでnative nanodiscとして切り出し精製を進めている。薄層クロマトグラフィーと質量分析により予備的な計測を行い、精製法を最適化している。
４．再構成膜における膜受容体の脂質制御の解析:EGFRの膜貫通-膜近傍領域を人工ペプチドとして作成し、再構成nanodisc中で１分子構造ダイナミクス計測を行った結果を論文発表した。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
RTKに関しては当初予定の１分子計測を終了しデータ解析の段階に入っている。全58種中52分子を計測したが、残りの分子は手持ちの各種ライブラリーから遺伝子が得られないか、HEK細胞で蛋白質が発現しないものである。３状態運動遷移がRTK共通の性質であることが分かったが、各々の動態パラメータは分子間で数倍の差が見られていることが多い。パラメータ値の再現性を確認した。網羅的な１分子受容体計測法が一通り完成したので、ヒトGPCRについても同様の計測を行っている。
RTK研究のプロトタイプと言えるEGFRの研究から、コレステロール、スフィンゴミエリンの作る膜ドメインとドメイン外を行き来することにより、受容体が２量体・多量体構造を選択し、機能発現していることが明らかになった。これは受容体の活性化・構造変化と周辺膜脂質の共役による巧妙な自己組織化現象であり、結果の一部を論文発表した (Maeda et al, JCS)。周辺脂質の再編成は、受容体機能の単なるon/offに使われているのではなく、リン酸化酵素と分子認識足場という受容体の異なった機能の時系列の沿った変換を実現するという重要な役割を持っている。この点に関して、さらに２本の論文を投稿・準備中である (Hiroshima et al. bioRxiv, Abe et al. in prep.) GPCRについてはangiotensin受容体において運動状態と関連したarrestinシグナル制御機構を発見し論文作成中である (Yanagawa, Toyota et al. in prep.)
細胞から切り出したnative nanodiscを用いて、受容体近傍脂質の生化学的な分析や受容体の１分子構造・反応ダイナミクスを計測するための準備にも進捗があった。
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| Strategy for Future Research Activity |
来年度は最終年度に当たる。以下の様な研究計画で各研究項目をさらに進捗・発展させるとともに、研究の取りまとめを行う。
１．RTK, GPCRの網羅的計測：結果を取りまとめ、活性化過程における動態の共通性と個別性を明らかにする。それぞれのRTKから数重の動態パラメータが得られている。まずこれらの値から52種のRTKのクラスタリングを行う。受容体の機能や、膜脂質との相互作用に重要な膜貫通・膜近傍領域の一次構造などから、動態と機能の関係を脂質制御の観点で明らかにしたい。類似の動態を示す分子間では、機能のクロストークが起こることも予想される。生化学的な方法も用いて、受容体間の機能連関を新たに発見できるかもしれない。GPCRは300種以上存在するが、現時点の技術で年度内には計測が終了すると期待している。
２．膜脂質と受容体の超解像可視化：これまで使ってきたPS, PIP2プローブに加えて、共同研究者によって新たに細胞質側コレステロールを認識する標識分子が得られ、イオンチャネル動態計測に応用した(Kuwashima et al. in prep.)。受容体近傍脂質解析にこのプローブを用いる。上記のようにEGFRとPS, PIP2について論文執筆中であるが、METに関しても同様の計測が進んでおり、RTK間を比較している。この研究についても論文化を図る。
３．膜受容体の境界脂質の分析：EGFR近傍脂質の分析が進行中である。この結果を取りまとめて、１分子動態や分子活性との関係を報告する。
４．再構成膜における膜受容体の脂質制御の解析：受容体の膜貫通-膜近傍ペプチド再構成系研究から推測された構造制御が全長受容体においても同様に働いていることを証明したい。そのためにnative nanodiscを基板に固定するための化学修飾法を作っている。disc中で受容体間の相互作用・構造変化を１分子計測する。
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| Assessment Rating |
Interim Assessment Comments (Rating)
A: In light of the aim of introducing the research area into the research categories, the expected progress has been made in research.
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