Analysis of the mechanism of stage conversion of Perkinsus species using transcriptomic approaches

• Project/Area Number: 19J00148
• Research Category: Grant-in-Aid for JSPS Fellows
• Allocation Type: Single-year Grants
• Section: 国内
• Review Section: Basic Section 40040:Aquatic life science-related
• Research Institution: Obihiro University of Agriculture and Veterinary Medicine
• Principal Investigator: 梅田 剛佑 帯広畜産大学, 原虫病研究センター, 特別研究員(PD)
• Project Period (FY): 2019-04-25 – 2022-03-31
• Project Status: Declined (Fiscal Year 2021)
• Budget Amount: ¥5,200,000 (Direct Cost: ¥4,000,000、Indirect Cost: ¥1,200,000); Fiscal Year 2021: ¥1,690,000 (Direct Cost: ¥1,300,000、Indirect Cost: ¥390,000); Fiscal Year 2020: ¥1,690,000 (Direct Cost: ¥1,300,000、Indirect Cost: ¥390,000); Fiscal Year 2019: ¥1,820,000 (Direct Cost: ¥1,400,000、Indirect Cost: ¥420,000)
• Keywords: パーキンサス属原虫 / Perkinsus olseni / ステージ転換 / トランスクリプトーム / RNA-seq / 遺伝子組換え / Perkinsus marinus / トランスクリプトーム解析 / 生活環

Outline of Research at the Start

パーキンサス属原虫は海産貝類に寄生し、大量死や資源量の減耗をもたらす深刻な病原性原虫である。しかし、その感染サイクルの成立に重要であるステージ転換に関する分子生物学的メカニズムは、これまで未解明なままである。本研究計画では、各ステージへの転換誘導条件下での遺伝子発現をトランスクリプトーム解析により比較し、各段階に特異的に発現する遺伝子を網羅的に同定する。さらに、これらの遺伝子をステージ転換の制御に関与する候補として遺伝子改変原虫を作製し、より詳細な性状・機能の解析を実施、本属原虫のステージ転換の分子生物学的な制御機構の解明を目指す。

Outline of Annual Research Achievements

本研究では、海産貝類に寄生するパーキンサス属原虫のステージ転換を制御する分子生物学的メカニズムの解明を目指している。前年度はステージ転換を誘導する培養条件を検討し、誘導培地中で培養したPerkinsus olseni栄養体（ATCC# PRA-181）を試料としてRNA-seqを実施した。
本年度はこのRNA-seqデータ（ステージ転換誘導開始0，1，6，24，96時間後）から遺伝子発現を定量し、各遺伝子の発現変動について時系列解析を行った。その結果、発現変動遺伝子は変動パターンに基づいて大きく９つのクラスターに分類された。この中には元は低めの発現であったがステージ転換誘導開始後に発現が急上昇し、終了後（96時間後）には発現が戻っていた遺伝子群、またもともと高めの発現であったが培養期間の早いタイミングで大きく発現が低下した遺伝子群など、ステージ転換の制御への関与が推測されるクラスターが検出された。また、当初は1反復のみのデータを解析していたが、今年度はさらに3反復のサンプルに対してRNA-seqを実施し、結果の再現性を確認した。
さらに、遺伝子機能推定のための技術開発として、遺伝子改変原虫の作製条件の検討を実施した。前年度はエレクトロポレーション法を用いたプラスミド導入によるGFP発現原虫の作製に成功していたが、導入・発現効率が低く、組換え原虫の選択の効率化が課題の一つであった。そこで本年度は、ピューロマイシン耐性遺伝子を利用した薬剤選択ベクターの提供を受け、P. olseniへの導入条件を検討した。ベクターを導入した原虫では薬剤存在下でもマーカーとなるGFPの発現が確認され、さらに栄養体の増殖も確認された。しかし、生残した栄養体の安定した増殖には数か月の時間を要したことから、薬剤耐性遺伝子の発現効率は高くないと推定され、発現プロモーターの変更など技術改良の必要性も示された。

Research Progress Status

翌年度、交付申請を辞退するため、記入しない。

Strategy for Future Research Activity

翌年度、交付申請を辞退するため、記入しない。

Research Products

• [Journal Article] CRISPR/Cas9 Ribonucleoprotein-Based Genome Editing Methodology in the Marine Protozoan Parasite Perkinsus marinus (2021)
  • Author(s): Yadavalli Raghavendra、Umeda Kousuke、Waugh Hannah A.、Tracy Adrienne N.、Sidhu Asha V.、Hern?ndez Derek E.、Fern?ndez Robledo Jose A.
  • Journal Title: Frontiers in Bioengineering and Biotechnology Volume: 9 Pages: 1-10
  • DOI: 10.3389/fbioe.2021.623278
  • Peer Reviewed / Open Access / Int'l Joint Research
• [Journal Article] Perkinsus marinus (2020)
  • Author(s): Yadavalli Raghavendra、Umeda Kousuke、Fern?ndez Robledo Jose A.
  • Journal Title: Trends in Parasitology Volume: 36 Issue: 12 Pages: 1013-1014
  • DOI: 10.1016/j.pt.2020.05.002
  • Peer Reviewed / Int'l Joint Research
• [Journal Article] The effects of environmental and nutritional conditions on the development of Perkinsus olseni prezoosporangia (2020)
  • Author(s): Umeda Kousuke、Yang Xia、Waki Tsukasa、Yoshinaga Tomoyoshi、Itoh Naoki
  • Journal Title: Experimental Parasitology Volume: 209 Pages: 107827-107827
  • DOI: 10.1016/j.exppara.2019.107827
  • Peer Reviewed