ゲノム編集法に基づく生体内網羅的スクリーニング法の確立とT細胞生成機構の理解

• Project/Area Number: 19J00248
• Research Category: Grant-in-Aid for JSPS Fellows
• Allocation Type: Single-year Grants
• Section: 国内
• Review Section: Basic Section 42040:Laboratory animal science-related
• Research Institution: The University of Tokyo
• Principal Investigator: 室 龍之介 東京大学, 大学院医学系研究科, 特別研究員(PD)
• Project Period (FY): 2019-04-25 – 2022-03-31
• Project Status: Completed (Fiscal Year 2021)
• Budget Amount: ¥4,810,000 (Direct Cost: ¥3,700,000、Indirect Cost: ¥1,110,000); Fiscal Year 2021: ¥1,560,000 (Direct Cost: ¥1,200,000、Indirect Cost: ¥360,000); Fiscal Year 2020: ¥1,560,000 (Direct Cost: ¥1,200,000、Indirect Cost: ¥360,000); Fiscal Year 2019: ¥1,690,000 (Direct Cost: ¥1,300,000、Indirect Cost: ¥390,000)
• Keywords: 胸腺 / T細胞 / 胸腺上皮細胞 / sgRNA / CRISPR/Cas9 / スクリーニング

Outline of Research at the Start

本研究では、sgRNAライブラリーとCas9ノックイン(KI)マウスを用いた生体内スクリーニング法を確立し、未熟T細胞から成熟T細胞に至る過程で必要とされる全ての遺伝子ならびに正負の選択に必要な遺伝子を網羅的に同定することを目的とする。これらの遺伝子を同定するために、一遺伝子をランダムに欠損したHSCライブラリーを樹立し、マウス胸腺内にてT細胞分化を再構築する。目的の分化段階に達した胸腺T細胞を単離し、ゲノム内に挿入されたsgRNA配列を次世代シークエンサー(NGS)によって読み解くことで、胸腺微小環境にておこるT細胞分化に必要な遺伝子および正負の選択を制御する遺伝子の網羅的同定を目指す。

Outline of Annual Research Achievements

これまでの成果から胸腺細胞の分化に関与しうる遺伝子群が同定された。本研究を進める過程で、遺伝子Xを胸腺上皮細胞特異的に欠損するマウス(X-cKOマウス)が作成された。X-cKOマウスは、胸腺の低形成や胸腺T細胞分化の障害を示したことから、その原因を究明する必要が生じた。よって、胸腺細胞の分化を支持する間質細胞に軸足をおいた研究も進めた。公共のデータベースおよび既報の遺伝子発現データを独自に解析した結果、遺伝子Xは胸腺上皮細胞の中でも胸腺髄質上皮細胞(mTEC)に高発現することが示された。そこで、X-cKOマウスのmTECを解析した結果、mTECの分化が顕著に障害されていた。mTECを精製し、Bulk-RNA sequence解析を行なったところ、遺伝子Xを欠損するmTECでは、数千の遺伝子が有意に発現低下したが、発現上昇する遺伝子はわずかであった。過去の報告からmTECは自己反応性T細胞の排除に重要であることが示されている。したがって、今後、X-cKOマウスにおける胸腺T細胞のレパトア変化や自己免疫疾患の発症について詳細に検証する必要がある。

Research Progress Status

令和3年度が最終年度であるため、記入しない。

Strategy for Future Research Activity

令和3年度が最終年度であるため、記入しない。

Research Products

• [Journal Article] The transcription factor Sox4 is required for thymic tuft cell development (2021)
  • Author(s): Mino Nanami、Muro Ryunosuke、Ota Ayami、Nitta Sachiko、Lefebvre Veronique、Nitta Takeshi、Fujio Keishi、Takayanagi Hiroshi
  • Journal Title: International Immunology Volume: 34 Issue: 1 Pages: 45-52
  • DOI: 10.1093/intimm/dxab098
  • Peer Reviewed / Open Access / Int'l Joint Research
• [Journal Article] The fibroblast: An emerging key player in thymic T cell selection (2021)
  • Author(s): Nitta Takeshi、Ota Ayami、Iguchi Takahiro、Muro Ryunosuke、Takayanagi Hiroshi
  • Journal Title: Immunological Reviews Volume: 302 Issue: 1 Pages: 68-85
  • DOI: 10.1111/imr.12985
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] tepwise cell fate decision pathways during osteoclastogenesis at single-cell resolution. (2021)
  • Author(s): Tsukasaki M, Huynh NC, Okamoto K, Muro R, Terashima A, Kurikawa Y, Komatsu N, Pluemsakunthai W, Nitta T, Abe T, Kiyonari H, Okamura T, Sakai M, Matsukawa T, Matsumoto M, Kobayashi Y, Penninger JM, Takayanagi H
  • Journal Title: Nat Metab Volume: 2 Issue: 12 Pages: 1382-1390
  • DOI: 10.1038/s42255-020-00318-y
  • Peer Reviewed / Open Access / Int'l Joint Research
• [Journal Article] OPG Production Matters Where It Happened. (2020)
  • Author(s): Tsukasaki M, Asano T, Muro R, Huynh NC, Komatsu N, Okamoto K, Nakano K, Okamura T, Nitta T, Takayanagi H
  • Journal Title: Cell Rep Volume: 32 Issue: 10 Pages: 1-10
  • DOI: 10.1016/j.celrep.2020.108124
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] Fibroblasts as a source of self-antigens for central immune tolerance (2020)
  • Author(s): Nitta Takeshi、Tsutsumi Masanori、Nitta Sachiko、Muro Ryunosuke、Suzuki Emma C.、Nakano Kenta、Tomofuji Yoshihiko、Sawa Shinichiro、Okamura Tadashi、Penninger Josef M.、Takayanagi Hiroshi
  • Journal Title: Nature Immunology Volume: 21 Issue: 10 Pages: 1172-1180
  • DOI: 10.1038/s41590-020-0756-8
  • Peer Reviewed / Open Access / Int'l Joint Research
• [Journal Article] Retroviral Gene Transduction into T Cell Progenitors for Analysis of T Cell Development in the Thymus (2020)
  • Author(s): Muro Ryunosuke、Takayanagi Hiroshi、Nitta Takeshi
  • Journal Title: Methods in Molecular Biology Volume: 2111 Pages: 193-203
  • DOI: 10.1007/978-1-0716-0266-9_16
  • ISBN: 9781071602652, 9781071602669
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Soluble RANKL is physiologically dispensable but accelerates tumour metastasis to bone (2019)
  • Author(s): Asano Tatsuo、Okamoto Kazuo、Nakai Yuta、Tsutsumi Masanori、Muro Ryunosuke、Suematsu Ayako、Hashimoto Kyoko、Okamura Tadashi、Ehata Shogo、Nitta Takeshi、Takayanagi Hiroshi
  • Journal Title: Nature Metabolism Volume: 1 Issue: 9 Pages: 868-875
  • DOI: 10.1038/s42255-019-0104-1
  • Peer Reviewed
• [Presentation] アルギニンメチル化による中枢性免疫寛容の確立 (2021)
  • Author(s): 室 龍之介、新田 剛、高柳 広
  • Organizer: 第30回 Kyoto T Cell Conference (KTCC)
• [Presentation] 中枢性免疫寛容の成立におけるアルギニンメチル基転移酵素の意義 (2021)
  • Author(s): 室 龍之介、新田 剛、高柳 広
  • Organizer: 第8回JCRベーシックリサーチカンファレンス
• [Presentation] 炎症性gdT細胞の分化における分子シグナル伝達 (2019)
  • Author(s): 室龍之介、新田剛、高柳広
  • Organizer: 第19回東京大学生命化学シンポジウム
• [Presentation] 炎症性gdT細胞の分化を誘導するTCRシグナルの解明 (2019)
  • Author(s): 室龍之介、新田剛、高柳広
  • Organizer: 第40回 日本炎症・再生医学会
• [Presentation] Molecular mechanism of Syk-mediated TCR signal in gdT cells (2019)
  • Author(s): 室龍之介、新田剛、高柳広
  • Organizer: 第48回日本免疫学会学術集会