幹細胞活性を持つCML微小残存病変の検出法開発と特性解明

• Project/Area Number: 19J00502
• Research Category: Grant-in-Aid for JSPS Fellows
• Allocation Type: Single-year Grants
• Section: 国内
• Review Section: Basic Section 54010:Hematology and medical oncology-related
• Research Institution: National Center for Global Health and Medicine
• Principal Investigator: 笠原 秀範 国立研究開発法人国立国際医療研究センター, 生体恒常性プロジェクト, 特別研究員(PD)
• Project Period (FY): 2019-04-25 – 2022-03-31
• Project Status: Declined (Fiscal Year 2021)
• Budget Amount: ¥4,030,000 (Direct Cost: ¥3,100,000、Indirect Cost: ¥930,000); Fiscal Year 2021: ¥1,300,000 (Direct Cost: ¥1,000,000、Indirect Cost: ¥300,000); Fiscal Year 2020: ¥1,300,000 (Direct Cost: ¥1,000,000、Indirect Cost: ¥300,000); Fiscal Year 2019: ¥1,430,000 (Direct Cost: ¥1,100,000、Indirect Cost: ¥330,000)
• Keywords: 慢性骨髄性白血病 / 微小残存病変 / 次世代シーケンサー

Outline of Research at the Start

白血病幹細胞活性を持つ微小残存病変（MRD）を検出する技術を創出し，それに基づいて性状を解析することは慢性骨髄性白血病（CML）治療の完結，すなわち化学療法の安全な中止とMRD標的療法の開発，に不可欠である．本研究開発を通じてCML幹細胞活性を持つMRDの生物学的特性の解析と患者ごとに個別化したMRD検出法を開発し，CMLの治療完結のための科学的な判断基準を提供するための基盤技術を確立することが最終的な目的である．

Outline of Annual Research Achievements

初発時の慢性骨髄性白血病（Chronic Myeloid Leukemia; CML）患者骨髄血から抽出したDNAに対して次世代シーケンサー（Next Generation Sequencing; NGS）で
22番と9番染色体の転座ゲノム切断点であるBreak pointを塩基配列レベルで同定した。Break pointは患者ごとに全く異なり、患者特異性が極めて高い配列であ
る。CML治療後の微小残存病変（Minimal Residual Disease; MRD）検出のために最終的にはNGSを用いたが、その値の定量を行うために、PCR（Polymerase Chain
Reaction）の中でも絶対定量が可能な手法であるデジタルPCR（dPCR）を用いた。MRDが患者のどの成分の中に含まれているものであるのかを細かく分画化して検索すべく、治療後の患者検体（骨髄血および末梢血）Flow cytometryにて細胞集団ごとにsortingして集め、DNA抽出した。
初発時サンプルに対するNGS解析により、15例の患者のうち14例でBreak pointを塩基レベルで正確に同定できた。dPCRでは、RNSPを用いた解析によりすべての治療後フローサイトソーティングを行った微量サンプルにゲノムが含まれていることを確認できた。また、dPCRでは検出できなかったサンプルでも解析精度の向上が見られた。2回PCRを行うことでBCR/ABL1存在頻度の直接定量ができなかった点についても、検量線サンプルをNGS解析時に加えることで定量可能となった。上記の手法の確立を進めたのち、TKI治療中の7名の患者に関して骨髄血および末梢血それぞれを4分画に細分化した集団から抽出したDNAに対してNGSによるMRD解析、およびその定量化を行ったデータをまとめて論文化した。

Research Progress Status

翌年度、交付申請を辞退するため、記入しない。

Strategy for Future Research Activity

翌年度、交付申請を辞退するため、記入しない。

Research Products

• [Journal Article] Inflammation-Induced Tumorigenesis and Metastasis (2021)
  • Author(s): Sana Hibino, Tetsuro Kawazoe, Hidenori Kasahara, Shinji Itoh, Takatsugu Ishimoto, Mamiko Sakata-Yanagimoto and Koji Taniguchi
  • Journal Title: International Journal of Molecular Sciences Volume: 22 Issue: 11 Pages: 5421-5421
  • DOI: 10.3390/ijms22115421
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] Interleukin-6-producing Intravascular Large B-cell Lymphoma with Lymphadenopathy Mimicking the Histology of Multicentric Castleman Disease (2020)
  • Author(s): Kohei Shiroshita, Taku Kikuchi, Mikio Okayama, Hidenori Kasahara, Takahiro Kamiya, Takayuki Shimizu, Nozomu Kurose, Yasufumi Masaki, Shinichiro Okamoto
  • Journal Title: Internal Medicine Volume: 59 Issue: 23 Pages: 3061-3065
  • DOI: 10.2169/internalmedicine.5046-20
  • NAID: 130007948790
  • ISSN: 0918-2918, 1349-7235
  • Year and Date: 2020-12-01
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] Detection of residual disease in chronic myeloid leukemia utilizing genomic next generation sequencing reveals persistence of differentiated Ph+ B cells but not bone marrow stem/progenitors (2020)
  • Author(s): Daiki Karigane, Hidenori Kasahara, ... , Keiyo Takubo.
  • Journal Title: Leukemia & Lymphoma Volume: 62 Issue: 3 Pages: 679-687
  • DOI: 10.1080/10428194.2020.1837366
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] Successful Treatment of End-stage Renal Disease in a Patient With Chronic Myeloid Leukemia by Kidney Transplantation and Tyrosine Kinase Inhibitors: A Case Report (2020)
  • Author(s): Kazunobu Shinoda , Shinya Morita , Satoshi Tamaki , Ryohei Takahashi , Sotaro Kitaoka , Hiroshi Asanuma , Tadashi Yoshida , Mikio Okayama , Hidenori Kasahara , Shinichiro Okamoto , Mototsugu Oya
  • Journal Title: Transplantation Proceedings Volume: 52 Issue: 2 Pages: 604-607
  • DOI: 10.1016/j.transproceed.2019.10.035
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Presentation] The Clinical Findings and Biology of CD25 As a Stem Cell Marker of CML (2019)
  • Author(s): Hidenori Kasahara, Daiki Karigane, Shinichiro Okamoto, Keiyo Takubo
  • Organizer: 21st Annual John Goldman Conference on Chronic Myeloid Leukemia, European School of Haematology
  • Int'l Joint Research
• [Patent(Industrial Property Rights)] 特許権 (2020)
  • Inventor(s): 田久保圭誉、雁金大樹、笠原秀範、佐々木貴史
  • Industrial Property Rights Holder: 田久保圭誉、雁金大樹、笠原秀範、佐々木貴史
  • Industrial Property Rights Type: 特許
  • Filing Date: 2020
• [Patent(Industrial Property Rights)] 特許権 (2020)
  • Inventor(s): 田久保圭誉、雁金大樹、笠原秀範、佐々木貴史
  • Industrial Property Rights Holder: 田久保圭誉、雁金大樹、笠原秀範、佐々木貴史
  • Industrial Property Rights Type: 特許
  • Filing Date: 2020