時空間的に内在性遺伝子を誘導する人工転写因子システムの開発

• Project/Area Number: 19J00883
• Research Category: Grant-in-Aid for JSPS Fellows
• Allocation Type: Single-year Grants
• Section: 国内
• Review Section: Basic Section 43050:Genome biology-related
• Research Institution: National Institute for Basic Biology
• Principal Investigator: 鈴木 美有紀 基礎生物学研究所, 生物機能解析センター, 特別研究員(PD)
• Project Period (FY): 2019-04-25 – 2022-03-31
• Project Status: Completed (Fiscal Year 2021)
• Budget Amount: ¥4,810,000 (Direct Cost: ¥3,700,000、Indirect Cost: ¥1,110,000); Fiscal Year 2021: ¥1,560,000 (Direct Cost: ¥1,200,000、Indirect Cost: ¥360,000); Fiscal Year 2020: ¥1,560,000 (Direct Cost: ¥1,200,000、Indirect Cost: ¥360,000); Fiscal Year 2019: ¥1,690,000 (Direct Cost: ¥1,300,000、Indirect Cost: ¥390,000)
• Keywords: 人工転写因子 / ゲノム編集 / 両生類 / トランスジェニック / 器官再生 / トランスクリプトーム解析

Outline of Research at the Start

器官形成や再生において、形態形成遺伝子の時空間的かつ厳密な制御はきわめて重要である。この問題に取り組むには、個体レベルで自由かつ時空間的に内在遺伝子を誘導できるシステムの開発が必要不可欠である。本申請課題では、単一細胞レベルで外来遺伝子を発現誘導する技術である赤外レーザー誘起遺伝子発現操作法(IR-LEGO)と、ゲノム編集技術を応用した人工転写因子システムを組み合わせ、任意の細胞において内在標的遺伝子を時空間的に誘導制御できるシステムの開発を行う。

Outline of Annual Research Achievements

ヒートショック(HS)転写因子HSF1は通常ヒートショックタンパク質(HSP)と結合して細胞質に存在し非活性化状態であるが、HSにより核内に移行しHS応答配列を持つ遺伝子群を活性化する。この原理を利用し、HSを与えた細胞でのみHSF1を核移行させ、SAMシステムを介して核内のdCas9-sgRNAに結合・集積することにより標的遺伝子の転写を活性化するシステムの開発を試みた。ヒト培養細胞を用いたルシフェラーゼレポーターアッセイの結果、MCP-マウスHSF1(mHSF1)を導入することで1.9倍の活性上昇が見られた。MCP-mHSF1依存的な転写活性化はHSなしの実験群でも見られたが、抗MCP抗体による免疫染色を行なったところ、HEK293T細胞においてはMCP-mHSF1がHS非依存的に核移行している様子が観察され、培養細胞においては条件によりHSF1の核細胞質局在が変化する問題が生じた。したがってMCP-mHSF1の集積による標的遺伝子の転写活性化には成功したが、最適化のための更なる検証にはin vivoの系の必要性が示された。そのためCRISPRを用いたより簡便な新規のトランスジェニック(Tg)手法の開発に着手し、複数の両生類Tgの作製に成功した。さらに光学系により時空間的に細胞のアブレーションが可能なイモリTgラインを樹立し、生殖系列への移行も確認した。開発した手法により人工転写因子の評価のためのTgラインの作製が容易となり、in vivoでのシステムの評価系が作製可能となった時点で研究を終了した。

Research Progress Status

令和3年度が最終年度であるため、記入しない。

Strategy for Future Research Activity

令和3年度が最終年度であるため、記入しない。

Research Products

• [Journal Article] A simple and practical workflow for genotyping of CRISPR-Cas9‐based knockout phenotypes using multiplexed amplicon sequencing (2020)
  • Author(s): Midori Iida Miyuki Suzuki Yuto Sakane Hiroyo Nishide Ikuo Uchiyama Takashi Yamamoto Ken‐ichi T. Suzuki Satoshi Fujii
  • Journal Title: Genes to Cells Volume: in press Issue: 7 Pages: 498-509
  • DOI: 10.1111/gtc.12775
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] A comprehensive reference transcriptome resource for the Iberian ribbed newt Pleurodeles waltl, an emerging model for developmental and regeneration biology (2019)
  • Author(s): Matsunami Masatoshi、Suzuki Miyuki、Haramoto Yoshikazu、Fukui Akimasa、Inoue Takeshi、Yamaguchi Katsushi、Uchiyama Ikuo、Mori Kazuki、Tashiro Kosuke、Ito Yuzuru、Takeuchi Takashi、Suzuki Ken-ichi T、Agata Kiyokazu、Shigenobu Shuji、Hayashi Toshinori
  • Journal Title: DNA Research Volume: 印刷中 Issue: 3 Pages: 217-229
  • DOI: 10.1093/dnares/dsz003
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Presentation] Unique gene program in newt limb development and regeneration (2021)
  • Author(s): 鈴木美有紀, 鈴木賢一
  • Organizer: 日本動物学会第92回大会
  • Invited
• [Presentation] Functional analysis for deciphering unique genetic program in newt limb regeneration (2019)
  • Author(s): Suzuki M, Suzuki KT
  • Organizer: EMBO Workshop - Limb development and regeneration: new tools for a classic model system
  • Int'l Joint Research
• [Presentation] CLiCKAR: a web tool for practical genotyping and evaluation of CRISPR-Cas9 based knockout phenotypes (2019)
  • Author(s): Iida M, Suzuki M, Sakane Y, Nishide H, Uchiyama I, Yamamoto T, Suzuki KT, Fujii S
  • Organizer: 日本ゲノム編集学会 第4回大会
• [Presentation] イベリアトゲイモリ四肢再生芽の分子解剖:Deep proteomicsおよびIso-Seq解析 (2019)
  • Author(s): 鈴木美有紀、清岡美穂、陳薇、豊田敦、鈴木賢一
  • Organizer: 先進ゲノム支援 拡大班会議2019
• [Book] Crispant:両生類における遺伝子機能解析「実験医学別冊ゲノム編集実験スタンダード」 (2019)
  • Author(s): 鈴木賢一、鈴木美有紀、林利憲
  • Total Pages: 15
  • Publisher: 羊土社
  • ISBN: 9784758122443
• [Remarks] イモリの再生能力の謎に迫る遺伝子カタログの作成 ～新規の器官再生研究モデル生物イベリアトゲイモリ～
  • URL: https://www.nibb.ac.jp/press/2019/04/24.html