ケミカルバイオロジーと遺伝子編集技術の融合による細胞周期の構成的な理解

• Project/Area Number: 19J01341
• Research Category: Grant-in-Aid for JSPS Fellows
• Allocation Type: Single-year Grants
• Section: 国内
• Review Section: Basic Section 44010:Cell biology-related
• Research Institution: Center for Novel Science Initatives, National Institutes of Natural Sciences
• Principal Investigator: 中村 彰伸 大学共同利用機関法人自然科学研究機構(新分野創成センター、アストロバイオロジーセンター、生命創成探究, 生命創成探究センター, 特別研究員(PD)
• Project Period (FY): 2019-04-25 – 2022-03-31
• Project Status: Completed (Fiscal Year 2021)
• Budget Amount: ¥4,810,000 (Direct Cost: ¥3,700,000、Indirect Cost: ¥1,110,000); Fiscal Year 2021: ¥1,560,000 (Direct Cost: ¥1,200,000、Indirect Cost: ¥360,000); Fiscal Year 2020: ¥1,560,000 (Direct Cost: ¥1,200,000、Indirect Cost: ¥360,000); Fiscal Year 2019: ¥1,690,000 (Direct Cost: ¥1,300,000、Indirect Cost: ¥390,000)
• Keywords: 局在性リガンド / 細胞膜 / 細胞周期制御 / 分裂酵母 / 細胞周期 / シグナル制御

Outline of Research at the Start

細胞周期は、主要な制御因子（CyclinやCDKなど）をノックアウト(KO)しても進行する堅牢な機構であることが示されている。一方で、従来の過剰発現やKOといった解析手法では、細胞周期制御因子の発現量が十分変化するまでにday単位の時間を必要とし、その間に補完が完結してしまい、細胞周期の堅牢性を構成する分子制御機構を正確に解析できないという問題が存在する。
本研究では、細胞周期制御因子を任意のタイミングで急速に活性化／不活性化するための汎用的な化合物ツールの開発を目指す。さらに本技術を用いることで、細胞周期制御因子がどれくらい細胞周期進行に寄与するかを定量的に明らかにすることを目指す。

Outline of Annual Research Achievements

本研究では、細胞周期制御因子を任意のタイミングで急速に活性化／不活性化するための小分子化合物ツールの開発と、それを用いた細胞周期制御因子の細胞周期進行への寄与を明らかにすることを目指す。本年度は、昨年度に確立した、局在性リガンドmDcTMPMeを用いたiK6DHFR融合タンパク質の細胞膜局在移行誘導システムを用いて、分裂酵母の内在性の細胞周期制御因子の強制的な細胞膜局在化と、それによる細胞周期進行の制御に取り組んだ。まず、分裂酵母の細胞周期進行の中心的な因子であるサイクリン依存キナーゼ（CDK1）を標的として選択し、染色体のCDK1遺伝子の終始コドンと3'UTR間にiK6DHFRと緑色蛍光タンパク質（mNeonGreen;以下ｍNG）、および薬剤選択マーカーをノックインした分裂酵母株を樹立した。このCDK1-iK6DHFR-mNGノックイン株は、mDcTMPMe未添加での培養時は、分裂形態や分裂速度は正常に保たれ、また、CDK1の局在（G1/S/G2期の核局在やM期における細胞質への移行）への影響が無いことを確認した。この細胞の培養液にmDcTMPMeを添加すると、CDK1-iK6DHFR-mNGは、核内から細胞膜へと移行した。この培養を継続すると、分裂酵母の細胞長が伸長／短縮され、同時に細胞分裂の遅延（細胞周期進行の阻害）が誘導されることが明らかとなった。さらにiK6DHFR/mDcTMPMeの系を用いて、核以外の局所領域（紡錘体極構造や微小管）に局在化する分裂酵母のさまざまな細胞周期制御因子を細胞膜へ移行誘導することで、さまざまな表現型を得ることにも成功した。本ツールは、分裂酵母の内在性タンパク質局在を制御することで細胞機能を制御するための汎用的な化合物ツールになるものと考えられる。以上の成果は、論文にまとめて発表する予定である。

Research Progress Status

令和3年度が最終年度であるため、記入しない。

Strategy for Future Research Activity

令和3年度が最終年度であるため、記入しない。

Research Products

• [Journal Article] Shedding light on developmental ERK signaling with genetically encoded biosensors (2021)
  • Author(s): Nakamura Akinobu、Goto Yuhei、Kondo Yohei、Aoki Kazuhiro
  • Journal Title: Development Volume: 148 Issue: 18
  • DOI: 10.1242/dev.199767
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Chemo-optogenetic protein translocation system using a photoactivatable self-localizing ligand (2021)
  • Author(s): Tatsuyuki Yoshii, Choji Oki, Rei Watahiki, Akinobu Nakamura, Kai Tahara, Keiko Kuwata, Toshiaki Furuta, Shinya Tsukiji
  • Journal Title: ACS Chemical Biology Volume: 16 Issue: 8 Pages: 1557-1565
  • DOI: 10.1021/acschembio.1c00416
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] A chemogenetic platform for controlling plasma membrane signaling and synthetic signal oscillation (2021)
  • Author(s): Yuka Hatano, Sachio Suzuki, Akinobu Nakamura, Tatsuyuki Yoshii, Kyoko Atsuta-Tsunoda, Kazuhiro Aoki, Shinya Tsukiji
  • Journal Title: bioRxiv Volume: ---
  • DOI: 10.1101/2021.03.16.435568
  • Open Access
• [Journal Article] Golgi recruitment assay for visualizing small-molecule ligand-target engagement in cells (2020)
  • Author(s): Sachio Suzuki, Masahiro Ikuta, Tatsuyuki Yoshii, Akinobu Nakamura, Keiko Kuwata, Shinya Tsukiji
  • Journal Title: Chemical Communications Volume: 56 Issue: 57 Pages: 7961-7964
  • DOI: 10.1039/d0cc02020f
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Protein-recruiting synthetic molecules targeting the Golgi surface (2020)
  • Author(s): Sawada Shunsuke、Nakamura Akinobu、Yoshii Tatsuyuki、Kuwata Keiko、Nakatsu Fubito、Tsukiji Shinya
  • Journal Title: Chemical Communications Volume: 56 Issue: 98 Pages: 15422-15425
  • DOI: 10.1039/d0cc06908f
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] Hoechst-tagged Fluorescein Diacetate for Fluorescence Imaging-based Assessment of Stomatal Dynamics in Arabidopsis thaliana (2020)
  • Author(s): Y. Takaoka, S. Miyagawa, A. Nakamura, S. Egoshi, S. Tsukiji, M. Ueda
  • Journal Title: Sci. Rep. Volume: 10 Issue: 1 Pages: 5333-5333
  • DOI: 10.1038/s41598-020-62239-w
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] Designer palmitoylation motif-based self-localizing ligand for sustained control of protein localization in living cells and Caenorhabditis elegans (2020)
  • Author(s): Akinobu Nakamura, Choji Oki, Shunsuke Sawada, Tatsuyuki Yoshii, Keiko Kuwata, Andrew K. Rudd, Neal K. Devaraj, Kentaro Noma, Shinya Tsukiji
  • Journal Title: ACS Chemical Biology Volume: 15 Issue: 4 Pages: 837-843
  • DOI: 10.1021/acschembio.0c00014
  • Peer Reviewed / Int'l Joint Research
• [Journal Article] Engineering orthogonal, plasma membrane-specific SLIPT systems for multiplexed chemical control of signaling pathways in living single cells (2020)
  • Author(s): Akinobu Nakamura, Choji Oki, Kenya Kato, Satoko Fujinuma, Gembu Maryu, Keiko Kuwata, Tatsuyuki Yoshii, Michiyuki Matsuda, Kazuhiro Aoki, Shinya Tsukiji
  • Journal Title: ACS Chemical Biology Volume: 15 Issue: 4 Pages: 1004-1015
  • DOI: 10.1021/acschembio.0c00024
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] Chemogenetic control of protein anchoring to endomembranes in living cells with lipid-tethered small molecules (2020)
  • Author(s): Akinobu Nakamura, Rika Katahira, Shunsuke Sawada, Eri Shinoda, Keiko Kuwata, Tatsuyuki Yoshii, Shinya Tsukiji
  • Journal Title: Biochemistry Volume: 59 Issue: 2 Pages: 205-211
  • DOI: 10.1021/acs.biochem.9b00807
  • Peer Reviewed
• [Presentation] SLIPT-PM: A new versatile chemogenetic platform for controlling plasma membrane signaling (2022)
  • Author(s): Sachio Suzuki, Yuka Hatano, Akinobu Nakamura, Kazuhiro Aoki, Shinya Tsukiji
  • Organizer: ACS Spring 2022
  • Int'l Joint Research
• [Presentation] 合成化合物の細胞内分解：酵素同定と一般性評価 (2021)
  • Author(s): 田原海、中村彰伸、市橋祐樹、浦野泰照、小松徹、築地真也
  • Organizer: 第52回中部化学関係学協会支部連合秋季大会
• [Presentation] 細胞膜シグナル制御のための汎用的な化学遺伝学ツールの開発 (2021)
  • Author(s): 鈴木祥央、波多野結香、中村彰伸、吉川優、吉井達之、青木一洋、築地真也
  • Organizer: 第15回バイオ関連化学シンポジウム
• [Presentation] Chemical and optogenetic tools for cell cycle regulation in fission yeast (2021)
  • Author(s): Akinobu Nakamura, Yuhei Goto, Shinya Tsukiji, Kazuhiro Aoki
  • Organizer: 3rd ExCELLS Retreat for Young Scientists
• [Presentation] 細胞膜局在性リガンドを用いた細胞内シグナル独立制御技術の開発 (2020)
  • Author(s): 中村彰伸、沖超二、真流玄武、吉井達之、松田道行、青木一洋、築地真也
  • Organizer: 第72回日本細胞生物学会大会
• [Presentation] 化合物・光遺伝学ツールを用いた分裂酵母の細胞周期制御 (2020)
  • Author(s): 中村彰伸、後藤祐平、築地真也、青木一洋
  • Organizer: CRESTオプトバイオ・新学術領域「レゾナンスバイオ」オンライン合同班会議
• [Presentation] Multiplexed chemical control of signaling pathways in living cells by orthogonal self-localizing ligand (SL)-induced protein translocation (SLIPT) (2020)
  • Author(s): Akinobu Nakamura, Choji Oki, Gembu Maryu, Tatsuyuki Yoshii, Michiyuki Matsuda, Kazuhiro Aoki, Shinya Tsukiji
  • Organizer: 8th Annual Winter q-bio conference
  • Int'l Joint Research
• [Presentation] 経時寿命を延長する分裂酵母変異株のスクリーニングと新規寿命関連因子の同定 (2020)
  • Author(s): 松井滉太朗、岡本啓佑、長谷川朋香、島崎嵩史、大塚北斗、井原邦夫、中村彰伸、後藤祐平、青木一洋、饗場 浩文
  • Organizer: 第14回日本ゲノム微生物学会年会
• [Presentation] 蛍光集積を指標とした動物細胞内タンパク質-薬剤相互作用検出 (2020)
  • Author(s): 鈴木祥央、生田雅裕、中村彰伸、吉井達之、築地真也
  • Organizer: 日本薬学会第140年会
• [Presentation] Development of nucleus-specific fluorescent dyes and nucleus imaging of mammalian and plant cells (2019)
  • Author(s): Akinobu Nakamura, Shinya Tsukiji, Kazuhiro Aoki
  • Organizer: Joint Meeting for Young Researchers on -Frontiers in Imaging Probes and Technologies-
  • Int'l Joint Research
• [Presentation] 細胞膜インナーリーフレットに局在する合成リポペプチドモチーフ (2019)
  • Author(s): 澤田隼佑、吉川優、中村彰伸、吉井達之、築地真也
  • Organizer: 日本ケミカルバイオロジー学会第14回年会
• [Presentation] 細胞内タンパク質の局在を動かすオプトケミカルジェネティクス (2019)
  • Author(s): 吉井達之、沖超二、中村彰伸、築地真也
  • Organizer: 日本ケミカルバイオロジー学会第14回年会
• [Presentation] Chemical tools for controlling protein localization in living cells (2019)
  • Author(s): Shinya Tsukiji, Akinobu Nakamura, Choji Oki, Tatsuyuki Yoshii
  • Organizer: 10th Joint RSC-CSJ Symposium: Chemistry for Complex Biological Systems
  • Int'l Joint Research
• [Presentation] 化学的アプローチによるタンパク質局在の光操作 (2019)
  • Author(s): 吉井達之、沖超二、中村彰伸、築地真也
  • Organizer: 第92回日本生化学会大会
• [Presentation] Multiplexed chemical control of signaling pathways by orthogonal self-localizing ligand-induced protein translocation (SLIPT) systems (2019)
  • Author(s): Akinobu Nakamura, Choji Oki, Gembu Maryu, Tatsuyuki Yoshii, Michiyuki Matsuda, Kazuhiro Aoki, Shinya Tsukiji
  • Organizer: The 2nd NIBB-Princeton Joint Symposium Imaging and Quantitative Biology
  • Int'l Joint Research
• [Presentation] SLIPT and photoSLIPT: chemical and optochemical tools for controlling protein localization in living cells (2019)
  • Author(s): Shinya Tsukiji, Akinobu Nakamura, Choji Oki, Tatsuyuki Yoshii
  • Organizer: Resonance Bio International Symposium
  • Int'l Joint Research
• [Remarks] Google Scholar
  • URL: https://scholar.google.co.jp/citations?hl=en&user=LP5rmmUAAAAJ
• [Remarks] ResearchGate
  • URL: https://www.researchgate.net/profile/Akinobu_Nakamura4
• [Patent(Industrial Property Rights)] 細胞膜又はゴルジ体に局在する化合物及びその使用 (2020)
  • Inventor(s): 築地真也、吉井達之、中村彰伸、沖超二、鈴木祥央、生田雅裕
  • Industrial Property Rights Holder: 築地真也、吉井達之、中村彰伸、沖超二、鈴木祥央、生田雅裕
  • Industrial Property Rights Type: 特許
  • Industrial Property Number: 2020-030868
  • Filing Date: 2020
• [Patent(Industrial Property Rights)] ゴルジ体に局在する化合物及びその使用 (2020)
  • Inventor(s): 築地真也、中村彰伸、澤田隼佑、吉井達之
  • Industrial Property Rights Holder: 築地真也、中村彰伸、澤田隼佑、吉井達之
  • Industrial Property Rights Type: 特許
  • Industrial Property Number: 2020-141893
  • Filing Date: 2020