| Project/Area Number |
19J12178
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| Research Category |
Grant-in-Aid for JSPS Fellows
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| Allocation Type | Single-year Grants |
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| Section | 国内 |
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| Review Section |
Basic Section 37030:Chemical biology-related
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| Research Institution | Osaka University |
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Principal Investigator |
高 靖馳 大阪大学, 工学研究科, 特別研究員(DC2)
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| Project Period (FY) |
2019-04-25 – 2021-03-31
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| Project Status |
Completed (Fiscal Year 2019)
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| Budget Amount *help |
¥1,700,000 (Direct Cost: ¥1,700,000)
Fiscal Year 2019: ¥900,000 (Direct Cost: ¥900,000)
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| Keywords | 生細胞イメージング / 蛍光プローブ / タンパク質分解 |
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| Outline of Research at the Start |
タンパク質の分解は細胞内環境の恒常性やシグナル伝達等を担う重要なプロセスであり、その破綻は様々な疾患につながる。タンパク質の分解を生きた細胞において可視化する技術は分解経路に対する理解を深めるだけでなく、創薬研究にも大きく貢献できる。本研究では、タンパク質を可視化する手法としてPYPタグラベル化法に着目し、PYPタグを標識する環境応答性発蛍光プローブがPYPタグに結合した時にのみ蛍光を発することを利用し、タンパク質分解の生細胞可視化技術を開発する。さらに、本技術を利用し、免疫応答の制御を担うRegnase-1の分解を可視化し、Regnase-1が関与する免疫経路の時空間的制御の理解を目指す。
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| Outline of Annual Research Achievements |
タンパク分解は様々な生命機能を担う経路であり、その破綻はがんや神経変性疾患などにつながる。そのため、タンパク分解のリアルタイム追跡法は、生命科学研究だけでなく、創薬研究にも非常に有用である。
研究代表者はこれまでに、PYPタグを用いる生細胞タンパク質ラベル化技術の開発に取り組み、PYPタグを可視化する蛍光プローブCG2を開発している。CG2は細胞内の水環境において蛍光を示さず、PYPタグと結合しその疎水性ポケットに入ることにより蛍光性となる。そこで、PYPタグが分解するとともにその疎水性ポケットが消失し、CG2は再び細胞内の水環境にさらされ非蛍光性となると考えられる。この蛍光の減少を、タンパク質の分解のリアルタイム可視化に応用することにした。
CG2によるタンパク質分解の蛍光観察を確認するために、試験管においてCG2とPYPタグを反応させ、タンパク質分解酵素であるトリプシンを反応系中に添加した。その結果、CG2の蛍光の減少が見られ、CG2をタンパク質分解の蛍光観察に応用できることを試験管内で証明した。
また、CG2とPYPタグが形成した複合体の安定性の向上に取り組み、CG2との相互作用を増やしたPYPタグの変異体PYPF96Dを開発した。PYPF96Dは生細胞において、CG2を用いる長時間にわたるタンパク質の観察を可能にした。
最後に、PYPF96D変異体とCG2を、免疫応答を制御するRegnase-1の分解の生細胞イメージングに応用した。Regnase-1－PYPF96Dを発現する細胞にCG2を添加しラベル化を行った後、リポ多糖（LPS）を添加したところ、時間経過とともにCG2の蛍光の減少が観察された。一方、LPS刺激を受けない細胞では蛍光の減少が見られなかった。また、LPSに応答するRegnase-1－PYPF96Dの分解をウエスタンブロット法によりも確認できた。
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| Research Progress Status |
翌年度、交付申請を辞退するため、記入しない。
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| Strategy for Future Research Activity |
翌年度、交付申請を辞退するため、記入しない。
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