| Project/Area Number |
19J12880
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| Research Category |
Grant-in-Aid for JSPS Fellows
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| Allocation Type | Single-year Grants |
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| Section | 国内 |
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| Review Section |
Basic Section 43020:Structural biochemistry-related
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| Research Institution | Kyoto University |
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Principal Investigator |
野島 慎五 京都大学, 医学研究科, 特別研究員(DC2)
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| Project Period (FY) |
2019-04-25 – 2021-03-31
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| Project Status |
Completed (Fiscal Year 2020)
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| Budget Amount *help |
¥2,100,000 (Direct Cost: ¥2,100,000)
Fiscal Year 2020: ¥1,000,000 (Direct Cost: ¥1,000,000)
Fiscal Year 2019: ¥1,100,000 (Direct Cost: ¥1,100,000)
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| Keywords | 膜タンパク質 / GPCR / プロスタグランジン / クライオ電子顕微鏡 / 構造解析 / X線結晶構造解析 |
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| Outline of Research at the Start |
プロスタグランジン（PG）は細胞間のシグナル伝達を行う物質の１種であり、炎症などの多様な生体反応を引き起こすことが知られている。PGの受容体は細胞膜上に存在しており、PGを受容するとシグナル伝達分子（Gタンパク質、β-アレスチン）を介して細胞内へシグナルを伝達していく。そのため、PG受容体は創薬ターゲットと考えられている。本研究ではPG受容体をGタンパク質と結合させた状態で精製し、得られたサンプルをX線構造解析およびクライオ電子顕微鏡単粒子解析の手法で分子レベルの構造を決定することで、PG受容体の活性化機構を解明することが目的である。
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| Outline of Annual Research Achievements |
今年度は昨年度にクライオ電子顕微鏡で撮影したEP4-miniGsβγ-Gs抗体の複合体の電子顕微鏡像を元に、単粒子解析法による構造解析を行い、分解能3.3オングストロームの３次元電子顕微鏡像を取得することに成功した。また、取得した電子顕微鏡像を元に原子座標モデルを構築することにも成功した。
得られた構造からEP4は、同じPGE2受容体であるEP3と同様のPGE2の結合様式をしていたが、リガンドポケットの最奥部にEP3にはない空間がEP4に存在することが判明した。また不活性型EP4に存在する、リガンドの侵入経路と思われる溝が活性型EP4では閉じていることが確認された。さらにEP4の細胞内側での膜貫通ヘリックス6（TM6）の開き具合は、他のGPCR-Gs複合体よりも小さいという特徴があった。この特徴のため、これまで解明されたGPCR-Gs複合体の構造では存在しなかった、TM2とGsのC末端との結合が確認された。これらの構造情報を元に、EP4のリガンドポケット部分およびGタンパク質結合部分のアミノ酸残基の変異体のプラスミドを作成し、HEK細胞で発現させた。このHEK細胞を利用し、cAMP依存的なルシフェラーゼを使用したレポーターアッセイによって、各残基の変異がGsシグナルの活性に及ぼす影響を調べた。その結果、リガンドポケット部分ではEP3で活性化に重要と考えられている残基に相当する残基がEP4でも活性に関与していることが明らかになった。またGタンパク質結合部分では、PG受容体に保存されているTM2のフェニルアラニン（Phe54）がEP4によるGsの活性化に重要であることが判明した。これらの知見は活性機構に基づいたEP4作動薬の開発への応用が期待される。そして以上の結果をまとめた論文を米国科学誌『Structure』に投稿し、12月１日にオンライン上で掲載された。
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| Research Progress Status |
令和2年度が最終年度であるため、記入しない。
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| Strategy for Future Research Activity |
令和2年度が最終年度であるため、記入しない。
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