エレクトロスプレー連続経時解析によるリアルタイム細胞内小器官オミクス計測

Research Project

Project/Area Number	19J13330
Research Category	Grant-in-Aid for JSPS Fellows
Allocation Type	Single-year Grants
Section	国内
Review Section	Basic Section 41040:Agricultural environmental engineering and agricultural information engineering-related
Research Institution	Ehime University
Principal Investigator	中田佳佑愛媛大学, 連合農学研究科, 特別研究員(DC2)
Project Period (FY)	2019-04-25 – 2021-03-31
Project Status	Completed (Fiscal Year 2020)
Budget Amount *help	¥2,100,000 (Direct Cost: ¥2,100,000) Fiscal Year 2020: ¥1,000,000 (Direct Cost: ¥1,000,000) Fiscal Year 2019: ¥1,100,000 (Direct Cost: ¥1,100,000)
Keywords	細胞膨圧 / プレッシャープローブ / 水ポテンシャル / 時空間分析 / １細胞分析 / オルガネラ / メタボロミクス / 質量分析 / 細胞内小器官 / 水分状態計測 / エレクトロスプレー
Outline of Research at the Start	セル・プレッシャープローブとエレクトロスプレーイオン化質量分析計を融合させたピコリットル・プレッシャープローブエレクトロスプレーイオン化質量分析法は，リアルタイムで非破壊状態の植物細胞の水分生理情報を把握しつつ，小器官単位での代謝物の細胞内局在・代謝動態を取得可能である．そこで，オオカナダモ葉細胞から葉緑体1個のみを取り出した後，キャピラリー内でイオン化効率を最大化するためのポストサンプリング処理を行う．また，採取した葉緑体に対して，マトリックス支援レーザー脱離イオン化を実行することで計測精度の確認を行う．
Outline of Annual Research Achievements	本研究では，１細胞メタボローム分析法であるピコリットル・プレッシャープローブ・エレクトロスプレーイオン化質量分析（picoPPESI-MS）を用い，その時空間分析の堅牢性をテストするとともに，細胞・オルガネラレベルでの現象解明を行った．まず，みつ入りリンゴにおいて，picoPPESI-MSと原理の異なる２つの浸透圧計（蒸気圧法，凝固点降下法）による１細胞空間分解能でのメタボローム分析，水分状態計測を行った．みつ果では，みつ部位の細胞で発酵代謝が誘導され，揮発性成分の集積に由来する浸透圧値の差が認められるとともに，外果皮からみつ部位に向かう水の流れと膨圧勾配が検出された．合成されたアルコール，エステル類のアポプラスト空間への移動・蓄積に伴う水移動から，これらの細胞生理要因が引き金となってみつ独特の外観変化（色差）を引き起こした．次に，生きたトマトトライコーム柄細胞の原形質流動，水分状態，代謝物を経時計測するとともに，透過型電子顕微鏡でミトコンドリアの塩ストレス順化について解析した．その結果，ストレス条件下で，膨圧低下に伴う過渡的なカルジオリピン合成とミトコンドリア内膜構造変化が誘導され，原形質流動速度が低下することなく，細胞内エネルギー代謝が維持された．最後に，栽培環境下でのオオカナダモの葉緑体の採取と，picoPPESI-MSによる高感度分析のための前処理法を検討した．標的細胞内の葉緑体径に合わせたキャピラリー先端の穴のサイズ調節・葉緑体1個を含む細胞溶液の採取・代謝分析を行った．試料の凍結・解凍による葉緑体膜の破壊により，葉緑体内代謝物抽出を試みた結果，葉緑体を含む複数のオルガネラ由来の代謝物の信号強度の向上が確認された．以上から， picoPPESI-MSのメタボローム分析，水分状態計測の時空間分析の堅牢性と，植物細胞・オルガネラスケールの現象解明への有効性が示された．
Research Progress Status	令和2年度が最終年度であるため、記入しない。
Strategy for Future Research Activity	令和2年度が最終年度であるため、記入しない。