試験管内再構成された環状DNA複製サイクルにおける転写翻訳反応の共役
| Project/Area Number |
19J20097
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| Research Category |
Grant-in-Aid for JSPS Fellows
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| Allocation Type | Single-year Grants |
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| Section | 国内 |
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| Review Section |
Basic Section 43040:Biophysics-related
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| Research Institution | Rikkyo University |
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Principal Investigator |
奈良 聖亜 立教大学, 理学研究科, 特別研究員(DC1)
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| Project Period (FY) |
2019-04-25 – 2022-03-31
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| Project Status |
Completed (Fiscal Year 2021)
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| Budget Amount *help |
¥2,500,000 (Direct Cost: ¥2,500,000)
Fiscal Year 2021: ¥800,000 (Direct Cost: ¥800,000)
Fiscal Year 2020: ¥800,000 (Direct Cost: ¥800,000)
Fiscal Year 2019: ¥900,000 (Direct Cost: ¥900,000)
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| Keywords | ゲノム複製 / 自己複製 |
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| Outline of Research at the Start |
生命の本質となる現象は、自身の遺伝情報を基に自己を増やす、即ち、自己複製することである。しかし、これまで、細胞が持つ自己複製の仕組みを試験管内で再構成した報告はなされていない。我々は、大腸菌ゲノムの複製システムを試験管内で再構成している。この再構成系は、ゲノムサイズの長大なDNAを増幅できる世界で唯一の複製系である。したがって、本研究では、この複製系と試験管内転写・翻訳反応の共役を行い、細胞が持つゲノムほどの遺伝情報を自己複製するシステムの構築を目指す。これによって、生命の自己複製における必要十分条件を明らかにしたい。
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究では、試験管内で再構成した大腸菌ゲノム複製反応(RCR)と転写・翻訳反応(PURE system)を共役させることによって自己複製システムの構築を目指す。RCRは、25種のタンパク質を用いて大腸菌ゲノム複製システムを再構成した系であり、複製開始起点oriCを含む環状DNAを指数関数的に増幅する反応である。RCRとPURE systemの共役は、RCRに必要な複製タンパク質を遺伝子として有するoriC環状DNA(自己複製ゲノム)を鋳型に、PURE systemを用いて複製タンパク質を産生し、さらに、産生した複製タンパク質を用いて鋳型となった自己複製ゲノムの増幅を導くことで達成される。これまでに、RCRに含まれる複製タンパク質の1つ(複製開始タンパク質DnaA)について、この共役に成功していた。しかし、鋳型ゲノムDNA分子が多数含まれるバルクの反応系では、産生されたDnaA分子が自身の鋳型ゲノムDNA分子以外を複製する可能性があるため、真に自己複製が達成されているとは言い難かった。そこで、油中水滴エマルジョンを用いて反応系を区画化し、1分子の鋳型ゲノムDNA毎に共役反応を行うことを検討した。この時、1分子の鋳型ゲノムDNA上で複製と転写が同時に起こるため、複製装置と転写装置の衝突を解消することが課題であった。既にバルクの共役系において、大腸菌で働く複製と転写の衝突回避機構が鋳型ゲノムDNAの増幅を促進することが明らかになっており、この機構をエマルジョンを用いた共役系にも導入したところ鋳型ゲノムDNAの増幅促進が見られた。この結果は、生命システムの根幹となるゲノムの自己複製を達成するためには複製と転写の協調的な進行が重要になることを示しており、細胞が実際に行う1分子のゲノムDNAを基にした複製・転写・翻訳、すなわちセントラルドグマを試験管内で再現することに繋がる。
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| Research Progress Status |
令和3年度が最終年度であるため、記入しない。
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| Strategy for Future Research Activity |
令和3年度が最終年度であるため、記入しない。
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Report
(3 results)
Research Products
(18 results)
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[Journal Article] Amplification of Over 100 kbp DNA from Single Template Molecules in Femtoliter Droplets2021
Author(s)
Ueno,H., Sawada,H., Soga,N., Sano,M., Nara,S., Tabata,K.V., Su’etsugu, M., Noji,H.
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Journal Title
ACS Synthetic Biology
Volume: 10
Issue: 9
Pages: 2179-2186
DOI
Related Report
Peer Reviewed / Open Access
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