構造生物学的手法を用いた、自然免疫受容体TLRのシグナル伝達機構の解明

• Project/Area Number: 19J21830
• Research Category: Grant-in-Aid for JSPS Fellows
• Allocation Type: Single-year Grants
• Section: 国内
• Review Section: Basic Section 43020:Structural biochemistry-related
• Research Institution: The University of Tokyo
• Principal Investigator: 坂庭 賢太朗 東京大学, 薬学系研究科, 特別研究員(DC1)
• Project Period (FY): 2019-04-25 – 2022-03-31
• Project Status: Completed (Fiscal Year 2021)
• Budget Amount: ¥2,500,000 (Direct Cost: ¥2,500,000); Fiscal Year 2021: ¥800,000 (Direct Cost: ¥800,000); Fiscal Year 2020: ¥800,000 (Direct Cost: ¥800,000); Fiscal Year 2019: ¥900,000 (Direct Cost: ¥900,000)
• Keywords: TLR / 自然免疫 / 構造生物学 / クライオ電子顕微鏡

Outline of Research at the Start

本研究は，自然免疫受容体の一つであるToll様受容体 (TLR) の担う膜を介した細胞内外のシグナル伝達について，全長タンパク質の構造解析を通じて理解することを目的とする。
この目的を達成するため，TLR全長試料を人工的な脂質二重膜環境であるナノディスク (ND) に再構成し、脂質二重膜上で性状解析およびクライオ電子顕微鏡での構造解析を行う。得られた情報を基に，シグナル伝達機構について考察し，TLRを起点とする自然免疫の分子メカニズムを明らかにすることを目指す。

Outline of Annual Research Achievements

本研究は，自然免疫において起点となる役割を担うToll様受容体（TLR）のシグナル伝達機構について，構造解析を通じて分子レベルで明らかにすることを目的としている。発現スクリーニングや発現系構築を行い，発現量の良好であったTLR3についての取り組みを進めている。
現在までにTLR3全長の可溶化試料を調製し，リガンドである二本鎖RNA（dsRNA）との結合活性を確認した。この試料を人工的な脂質二重膜粒子であるナノディスク（ND）に再構成する条件を検討し，脂質二重膜上で活性化状態を形成したTLR3/dsRNA複合体試料の調製を達成した。クライオ電子顕微鏡を用いて活性化状態での構造解析を行ったところ，～3.3オングストローム分解能で二量体の細胞外ドメイン構造が確認された。全長試料において細胞外ドメインの活性化構造を確認
できた一方で，膜貫通領域および細胞内ドメインでは構造決定に至る明瞭な密度を観測することができていない。この点に関して，TLR3の細胞内アダプタータンパク質であるTRIFを調製し，TLR3/dsRNAと複合体を形成することを確認した。しかしながら，このTLR3/dsRNA/TRIF複合体においても膜貫通領域および細胞内領域の密度は不明瞭であり，構造決定には至らなかった。
上記の検討の中で，TLR3が二量体よりも大きな会合状態を形成する可能性が示唆されたため，長鎖dsRNAを用いてTLR3の多量体形成について検証を行った。その結果，TLR3/90 bp dsRNAを用いてTLR3四量体のクライオ電顕構造を決定することができた。TLR3の多量体化によりTRIFの効率的な会合を促進しているものと考えられる。以上の結果から，TLR3の多量体化という新たな分子機構を提示することができた。

Research Progress Status

令和3年度が最終年度であるため、記入しない。

Strategy for Future Research Activity

令和3年度が最終年度であるため、記入しない。

Research Products

• [Journal Article] Tetrasubstituted imidazoles as incognito Toll-like receptor 8 a(nta)gonists (2021)
  • Author(s): Yang Yi、Csakai Adam、Jiang Shuangshuang、Smith Christina、Tanji Hiromi、Huang Jian、Jones Torey、Sakaniwa Kentaro、Broadwell Lindsey、Shi Chengrui、Soti Subada、Ohto Umeharu、Fang Yaohui、Shen Shu、Deng Fei、Shimizu Toshiyuki、Yin Hang
  • Journal Title: Nature Communications Volume: 12 Issue: 1 Pages: 4351-4351
  • DOI: 10.1038/s41467-021-24536-4
  • Peer Reviewed / Open Access / Int'l Joint Research
• [Journal Article] Rationally Designed Small-Molecule Inhibitors Targeting an Unconventional Pocket on the TLR8 Protein-Protein Interface (2020)
  • Author(s): Jiang Shuangshuang、Tanji Hiromi、Yin Kejun、Zhang Shuting、Sakaniwa Kentaro、Huang Jian、Yang Yi、Li Jing、Ohto Umeharu、Shimizu Toshiyuki、Yin Hang
  • Journal Title: Journal of Medicinal Chemistry Volume: 63 Issue: 8 Pages: 4117-4132
  • DOI: 10.1021/acs.jmedchem.9b02128
  • Peer Reviewed / Int'l Joint Research
• [Journal Article] Targeting the innate immune receptor TLR8 using small-molecule agents (2020)
  • Author(s): Sakaniwa Kentaro, and Toshiyuki Shimizu.
  • Journal Title: Acta Crystallographica Section D: Structural Biology Volume: 76 (7) Issue: 7 Pages: 621-629
  • DOI: 10.1107/s2059798320006518
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] Discovery of Novel Small Molecule Dual Inhibitors Targeting Toll-like Receptor 7 and 8 (2019)
  • Author(s): Padilla-Salinas, R., Anderson, R., Sakaniwa, K., Zhang, S., Nordeen, P., Lu, C., Shimizu, T., Yin, H.
  • Journal Title: J.Med.Chem. Volume: 62 Issue: 22 Pages: 10221-20244
  • DOI: 10.1021/acs.jmedchem.9b01201
  • Peer Reviewed / Int'l Joint Research
• [Presentation] TLR3は効率的なシグナル伝達のためにdsRNA上で多量体を形成する (2022)
  • Author(s): 坂庭 賢太朗，柴田 琢磨，重松 秀樹，山本 雅貴，三宅健介，大戸梅治，清水敏之
  • Organizer: 日本薬学会第142年会（名古屋）
• [Presentation] ntagonist-inactivation mechanism of innate immune receptor TLR8 revealed by X-ray crystal structure analysis (2019)
  • Author(s): Kentaro Sakaniwa; Hiromi Tanji; Shuting Zhang; Zhenyi Hu; Hang Yin; Umeharu Ohto; Toshiyuki Shimizu
  • Organizer: International Symposium on Diffraction Structural Biology 2019
  • Int'l Joint Research