基質模倣物による水酸化酵素の制御を利用した菌体内物質変換系の開発
| Project/Area Number |
19J23669
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| Research Category |
Grant-in-Aid for JSPS Fellows
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| Allocation Type | Single-year Grants |
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| Section | 国内 |
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| Review Section |
Basic Section 38020:Applied microbiology-related
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| Research Institution | Nagoya University |
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Principal Investigator |
唐澤 昌之 名古屋大学, 理学研究科, 特別研究員(DC1)
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| Project Period (FY) |
2019-04-25 – 2022-03-31
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| Project Status |
Completed (Fiscal Year 2021)
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| Budget Amount *help |
¥3,100,000 (Direct Cost: ¥3,100,000)
Fiscal Year 2021: ¥1,000,000 (Direct Cost: ¥1,000,000)
Fiscal Year 2020: ¥1,000,000 (Direct Cost: ¥1,000,000)
Fiscal Year 2019: ¥1,100,000 (Direct Cost: ¥1,100,000)
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| Keywords | バイオ触媒 / 菌体触媒 / シトクロムP450 / 酸化反応 / デコイ分子 / 擬似基質 / 大腸菌 / ポリン |
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| Outline of Research at the Start |
ベンゼンに代表される不活性な石油由来炭化水素を、より有用な化合物へと変換する菌体触媒の開発を行う。シトクロムP450BM3は長鎖脂肪酸の水酸化酵素であり、基質模倣物(擬似基質)によって基質選択性を変換できる。本研究では、P450BM3を過剰発現させた大腸菌に擬似基質を取り込ませることで、菌体内で基質の水酸化が進行する新規反応系を構築する。また、擬似基質の構造を調整し、菌体反応に有効な擬似基質の創製や、菌体自身が擬似基質を生産する反応開発を目指す。
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| Outline of Annual Research Achievements |
水酸化酵素であるP450BM3 (BM3) は、擬似基質（デコイ分子）によって基質特異性を変換できる。これまでに、BM3を発現させた大腸菌にデコイ分子を取り込ませることで、菌体内の補酵素再生系を利用して非天然基質の水酸化が進行することを明らかにしている。また、外膜タンパク質OmpFの変異体をBM3と共発現させることで、菌体反応が促進されることを見出している。OmpF変異体の機能を精査するため、ピレンを部分骨格として有するデコイ分子を模した蛍光分子を合成し、大腸菌への取り込みを評価した。蛍光分子を大腸菌の懸濁液に加えてインキュベートし、顕微鏡で観察したところ、OmpF変異体を発現させた大腸菌からのみ明瞭な蛍光が観測された。また、培養後の上清の紫外可視吸収スペクトルを測定し、蛍光分子の吸収から菌体への取り込み効率を算出したところ、野生型OmpFを発現させた大腸菌では取り込み効率が11%であったのに対し、OmpF変異体を発現させた場合では74%に増加した。以上の結果から、OmpF変異体が擬似基質の取り込みを促進していることが示唆された。また、天然物が擬似基質として機能するかを調査するため、アシルホモセリンラクトン(CnHSL)とアシルホモセリン(CnHS)の存在下、BM3によるベンゼンの水酸化を行った。AHSLの中では炭素鎖8のものが、AHSの中では9のものが酵素反応を効果的に促進し、C9HSの存在下、BM3は毎分24回ベンゼンを酸化した。X線結晶構造解析から、C12HSLのラクトン環はC16HSのカルボキシ基よりもBM3の基質結合部位の奥に固定化されていることが明らかとなり、酵素反応で観測された鎖長依存性の差は、両者の結合状態の違いに起因していると推測している。菌体自身がデコイ分子を生合成する新しい菌体触媒の開発につながることが期待される。
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| Research Progress Status |
令和3年度が最終年度であるため、記入しない。
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| Strategy for Future Research Activity |
令和3年度が最終年度であるため、記入しない。
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Report
(3 results)
Research Products
(6 results)
