全自動NMR構造解析システムを用いた高分子量タンパク質の解析

• Project/Area Number: 19J40094
• Research Category: Grant-in-Aid for JSPS Fellows
• Allocation Type: Single-year Grants
• Section: 国内
• Review Section: Basic Section 43020:Structural biochemistry-related
• Research Institution: Osaka University
• Principal Investigator: 古板 恭子 大阪大学, 蛋白質研究所, 特別研究員(RPD)
• Project Period (FY): 2019-04-25 – 2022-03-31
• Project Status: Completed (Fiscal Year 2021)
• Budget Amount: ¥4,030,000 (Direct Cost: ¥3,100,000、Indirect Cost: ¥930,000); Fiscal Year 2021: ¥1,300,000 (Direct Cost: ¥1,000,000、Indirect Cost: ¥300,000); Fiscal Year 2020: ¥1,300,000 (Direct Cost: ¥1,000,000、Indirect Cost: ¥300,000); Fiscal Year 2019: ¥1,430,000 (Direct Cost: ¥1,100,000、Indirect Cost: ¥330,000)
• Keywords: 溶液NMR / フロリゲン / 立体構造 / LLPS / 機械学習 / タンパク質

Outline of Research at the Start

溶液NMR法は、X線や電子顕微鏡と異なり、生体内に近い溶液中でのタンパク質・核酸の立体構造決定が可能であるという優れた特徴がある。しかしながら、溶液NMRによる立体構造決定には分子量制限があり、高分解能構造決定が可能なのは分子量2～3万までである。そこで本研究では、サンプル調製の工夫や新規NMR測定法の開発を行うとともに、大阪大学において開発された全自動NMR解析システムを高分子量タンパク質に最適化することで、溶液NMR法による立体構造決定の分子量制限を5万程度に緩和することを目指す。

Outline of Annual Research Achievements

溶液NMR法は、生体内に近い溶液中でのタンパク質・核酸の立体構造決定が可能であるという優れた特徴がある。しかしながら、溶液NMRによる立体構造決定は分子量が2万以上では急激に難しくなる。本研究では、高分子量タンパク質の迅速な立体構造決定を可能とする解析法の確立を目指した。また、開発する解析法を用いて、分子量約2万の「フロリゲン」と5.5万の「フロリゲン受容体」の研究を実施した。これまでにアミノ酸選択的標識と新規測定法の開発を組み合わせてデータを取得し、全自動構造解析システムを利用することで、分子量約5.5万の「フロリゲン受容体」の主鎖帰属を達成した。また、全自動構造解析システムを用いて「フロリゲン」の化学シフトの帰属及び立体構造決定を達成しつつある。2021年度は次の通り「フロリゲン」の液液層分離（LLPS）形成機構の解析を実施した。
近年、共同研究者により「フロリゲン」は単独、あるいは「フロリゲン受容体」とともに液液層分離（LLPS）を形成することが明らかになった。研究代表者は過去のデータから、フロリゲンのC末端側８残基ほどの領域がLLPS形成に重要であると予測した。そこでこの領域の変異体を数種類作成し、LLPS形成能を評価したところ、野生型と比べて、「フロリゲン受容体」との複合体としてのLLPS形成が大きく減弱していることがわかった。そこで溶液NMRを用い、LLPS形成能が減弱した変異体Aと野生型を比較した。変異による化学シフト変化はほとんどなく、変異体Aは野生型とほぼ同じ構造を取ると考えられた。また、それぞれの運動性を調べたが、運動性にも目立った違いはなかった。次に「フロリゲン受容体」との結合能を評価したところ、変異体Aは「フロリゲン受容体」との結合力が減弱していることがわかった。「フロリゲン」のLLPS形成メカニズムについてはさらなる研究が必要である。

Research Progress Status

令和3年度が最終年度であるため、記入しない。

Strategy for Future Research Activity

令和3年度が最終年度であるため、記入しない。

Research Products

• [Journal Article] Sensitivity enhancement by sequential data acquisition for 13C-direct detection NMR (2021)
  • Author(s): Furuita Kyoko、Sugiki Toshihiko、Takamuku Mika、Hattori Yoshikazu、So Masatomo、Kawata Yasushi、Ikegami Takahisa、Fujiwara Toshimichi、Kojima Chojiro
  • Journal Title: Journal of Magnetic Resonance Volume: 322 Pages: 106878-106878
  • DOI: 10.1016/j.jmr.2020.106878
  • Peer Reviewed
• [Presentation] 小胞体膜貫通タンパク質VAPのペプチド認識機構の研究 (2020)
  • Author(s): 古板恭子, 平岡万里菜, 藤原敏道, 児嶋長次郎
  • Organizer: 第59回NMR討論会
• [Presentation] 好冷性細菌 Anabaena variabilis由来のグリシンリッチドメインを持たないRNA結合タンパク質RbpDの溶液構造の特徴 (2020)
  • Author(s): 森田勇人，田中邑樹，古板恭子，杉木俊彦，児嶋長次郎
  • Organizer: 第59回NMR討論会
• [Presentation] 13C直接観測測定の高感度化法の開発 (2019)
  • Author(s): 古板恭子, 服部良一, 杉木俊彦, 池上貴久, 藤原敏道, 児嶋長次郎
  • Organizer: 第58回NMR討論会
• [Presentation] 花成ホルモン蛋白質のNMR解析および19F-NMRスクリーニング (2019)
  • Author(s): 安澤すあい, 新家粧子, 古板恭子, 小篭蒼, 田岡健一郎, 辻寛之, 藤原敏道, 児嶋長次郎
  • Organizer: 第58回NMR討論会
• [Presentation] VAP結合蛋白質群が持つVAP認識モチーフのNMR解析 (2019)
  • Author(s): 平岡万里菜, 古板恭子, 藤原敏道, 児嶋長次郎
  • Organizer: 第58回NMR討論会