小胞体ーゴルジ体を経由しないガレクチン新規分泌経路の解明
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19J40312
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| Research Category |
Grant-in-Aid for JSPS Fellows
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| Allocation Type | Single-year Grants |
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| Section | 国内 |
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| Review Section |
Basic Section 43030:Functional biochemistry-related
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| Research Institution | Kochi University |
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Principal Investigator |
山口 亜利沙 高知大学, 教育研究部医療学系, 特別研究員(RPD)
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| Project Period (FY) |
2019-10-01 – 2023-03-31
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| Project Status |
Completed (Fiscal Year 2022)
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| Budget Amount *help |
¥4,810,000 (Direct Cost: ¥3,700,000、Indirect Cost: ¥1,110,000)
Fiscal Year 2022: ¥650,000 (Direct Cost: ¥500,000、Indirect Cost: ¥150,000)
Fiscal Year 2021: ¥1,560,000 (Direct Cost: ¥1,200,000、Indirect Cost: ¥360,000)
Fiscal Year 2020: ¥1,560,000 (Direct Cost: ¥1,200,000、Indirect Cost: ¥360,000)
Fiscal Year 2019: ¥1,040,000 (Direct Cost: ¥800,000、Indirect Cost: ¥240,000)
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| Keywords | ガレクチン / 非古典的分泌経路 / EMARS / プロテオミクス / 分子会合 / 非古典的経路分泌 |
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| Outline of Research at the Start |
本研究は、積年の謎であるガレクチンの細胞外分泌機構の解明を目指し、申請者が独自に開発した発現HRP融合タンパク質による高特異性EMARS法を用いてガレクチン３の分泌を司る分子群を網羅的に突き止める。この際、種々の分泌条件下にて細胞内小胞及び細胞膜上のガレクチン３会合分子群を同定することで、分泌経路を特定する。さらに、個々のガレクチン３会合分子を欠失させて、ガレクチン３分泌への影響を評価し、ガレクチン３の細胞外分泌に必要な分子を明らかにする。本研究によりガレクチン分泌機構解明に突破口を開くことができれば、ガレクチンが寄与するがん細胞の増殖、進展を制御するための基盤的知見を得ることができる
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| Outline of Annual Research Achievements |
独自に開発した第２世代EMARS法を用いて、積年の謎であるガレクチンの細胞外分泌機構の解明に挑んだ。ガレクチン３の分泌に寄与する分子を見つけるために、ガレクチン３の分泌を制御する薬剤の探索、ガレクチンとEMARS反応触媒酵素のキメラタンパク質の発現、ガレクチン３と会合する分子の同定を計画し、研究を進めた。昨年まで、ガレクチン３変異体（R186S）は分泌が抑制されることや、コレステロール輸送体阻害剤U18666A処理によりガレクチン３濃縮小胞が形成され分泌が促進されることを見出した。これら分泌速度の異なる諸条件について、発現mCherry-APEX-ガレクチン３を用いたEMARS反応を行い、SILAC法によるサブトラクション解析を行った。その結果、mCherry-APEX-ガレクチン３の近傍に存在する分子として、アクチン結合関連分子(αactinin-4,Caplin-1,Transgelin-2, cortactin, FilaminA,Profilin-1） が多数検出された。さらに、アクチン重合阻害剤であるサイトカラシンにより、ガレクチン３の分泌が抑制された。また、ガレクチン３の分泌が促進されるU18666Aを添加した条件においてもSILAC法による質量分析を行った。その結果、mCherry-APEX-ガレクチン３の近傍に存在する分子として、Rab5が同定された。Rab5を免疫染色し、共焦点顕微鏡にて観察したところ、U18666A添加時に形成される濃縮小胞と一致した。これらのことから、アクチン結合関連分子およびRab5がガレクチン3の分泌に関与している可能性が示唆された。なお、mCherry-APEX-ガレクチン３の近傍に存在する分子として内在的に発現するガレクチン３自体が検出されたので、EMARS法の実験系はうまく機能していると思われた。
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| Research Progress Status |
令和4年度が最終年度であるため、記入しない。
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| Strategy for Future Research Activity |
令和4年度が最終年度であるため、記入しない。
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Report
(4 results)
Research Products
(5 results)
