Elucidation of the molecular mechanism in transcriptional regulatory complex of human LRH-1 by X-ray crystallography and Cryo-EM

• Project/Area Number: 19K05706
• Research Category: Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
• Allocation Type: Multi-year Fund
• Section: 一般
• Review Section: Basic Section 37010:Bio-related chemistry
• Research Institution: High Energy Accelerator Research Organization
• Principal Investigator: 湯本 史明 大学共同利用機関法人高エネルギー加速器研究機構, 物質構造科学研究所, 特任准教授 (30360150)
• Project Period (FY): 2019-04-01 – 2020-03-31
• Project Status: Discontinued (Fiscal Year 2019)
• Budget Amount: ¥4,290,000 (Direct Cost: ¥3,300,000、Indirect Cost: ¥990,000); Fiscal Year 2021: ¥1,300,000 (Direct Cost: ¥1,000,000、Indirect Cost: ¥300,000); Fiscal Year 2020: ¥1,300,000 (Direct Cost: ¥1,000,000、Indirect Cost: ¥300,000); Fiscal Year 2019: ¥1,690,000 (Direct Cost: ¥1,300,000、Indirect Cost: ¥390,000)
• Keywords: 核内受容体 / 転写因子複合体 / X線結晶構造解析 / クライオ電子顕微鏡 / X線小角散乱解析 / クライオ電子顕微鏡解析 / LRH-1

Outline of Research at the Start

最近、大規模な遺伝子解析、更には膵臓癌細胞の研究から、核内受容体LRH-1の遺伝子発現制御機構の破綻が膵臓癌と関係することが示され、創薬ターゲットとして注目されている。つまり、LRH-1の機能を抑制することができれば、膵臓癌に対する創薬において新たな道が拓かれる可能性が期待される。本研究では4つのドメインからなる全長LRH-1が活性化因子やDNAに結合した状態として、X線結晶構造解析、X線溶液散乱解析、クライオ電子顕微鏡解析によって立体構造を解明し、ドメイン間相互作用の分子機構を解明すると共に、新たなターゲット界面を見出すことにより、LRH-1の分子創薬基盤を構築する。

Outline of Annual Research Achievements

Liver receptor Homologue-1（LRH-1もしくはNR5A2）は初期発生で重要な役割を担うばかりりでなく、肝臓、膵臓、卵巣においても遺伝子発現制御を担う核内受容体（Nuclear Hormone Receptor）の1つである。胚性幹細胞（ES細胞）においてOct3/4の発現制御も行っていることが示されていると共に、人工多能性幹細胞（iPS細胞）の誘導においてもOct3/4を代替しうる因子であることが示されるなど、幹細胞との関わりも深いタンパク質である。さらに、この転写因子はステロイドの代謝やコレステロール、胆汁酸のホメオスタシスにも関わるのみならず、乳癌、すい臓癌といった癌との関連も報告されている。このような背景から、LRH-1分子をターゲットにした低分子の薬剤候補化合物のスクリーニングが米国を中心に行われてきている。すなわち、基礎生物学としてのみならず、医学や薬学の観点からも注目されている分子である。
このLRH-1はN末端からN末端ドメイン、DNA-binding domain（DBD）、天然変性領域からなるヒンジ領域、Ligand-binding domain（LBD）から構成されるが、このLRH-1分子については、LRH-1全長、DBD-ヒンジ-LBD、DBD単独、ヒンジ-LBD、LBDの発現・精製コンストラクトを作成し、特に全長分子がDNA2重鎖に結合した形での立体構造解析を試みてきた。これまでX線結晶構造解析のための結晶化に取り組んだが、結晶が得られなかったことから、X線結晶小角散乱解析を試みた。また、精製用タグ除去によるサンプル精製条件の最適化に取り組み、クライオ電子顕微鏡解析を試みたが、サンプルの自己会合が観察された。今後、単粒子解析を行うためにはさらに精製条件を最適化し、安定な条件を見出す必要があることがわかった。