部位特異的遺伝子増幅機能を応用した放線菌二次代謝産物生産能力増強システムの構築

• Project/Area Number: 19K05779
• Research Category: Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
• Allocation Type: Multi-year Fund
• Section: 一般
• Review Section: Basic Section 38020:Applied microbiology-related
• Research Institution: Kitasato University
• Principal Investigator: 小松 護 北里大学, 感染制御科学府, 講師 (40414057)
• Project Period (FY): 2019-04-01 – 2022-03-31
• Project Status: Discontinued (Fiscal Year 2021)
• Budget Amount: ¥3,640,000 (Direct Cost: ¥2,800,000、Indirect Cost: ¥840,000); Fiscal Year 2021: ¥1,170,000 (Direct Cost: ¥900,000、Indirect Cost: ¥270,000); Fiscal Year 2020: ¥1,170,000 (Direct Cost: ¥900,000、Indirect Cost: ¥270,000); Fiscal Year 2019: ¥1,300,000 (Direct Cost: ¥1,000,000、Indirect Cost: ¥300,000)
• Keywords: 放線菌 / 二次代謝産物 / 遺伝子増幅 / 物質生産 / 線状プラスミド / 異種発現 / 生合成遺伝子

Outline of Research at the Start

放線菌Streptomyces avermitilisのゲノム縮小株(SUKA)における、zouA遺伝子産物の部位特異的遺伝子増幅機能を応用した異種(微)生物由来の二次代謝産物生産能力増強システムを構築することを目的とする。SUKA株染色体上へzouA遺伝子を導入し、その効果を比較検討する。同様に構成的ならびに誘導型プロモーターを用いたzouA発現システムの構築を行い、培養過程で遺伝子増幅に最も効果的な発現時期について詳細な検討を行う。再現性の良い部位特異的遺伝子増幅システムの構築を行い種々の異種微生物由来の二次代謝産物生合成遺伝子群を導入する事によって、その生産性について検証する。

Outline of Annual Research Achievements

放線菌Streptomyces avermitilisのゲノム縮小株(SUKA)における、S. kanamyceticusならびにStreptomyces sp. RM04株由来のZouAの部位特異的遺伝子増幅機能を応用した二次代謝産物生産能力増強システムを構築した。zouA_kanをRsB-attBs-RsA-zouA_kanの並びでカセット化し、線状プラスミドSAP1に導入した。chloramphenicol(Cml)生合成遺伝子を含むpCML2をSAP1上のattBサイトに導入した。pCML2の選択マーカーであるapramycin耐性遺伝子を利用し、培地中のapramycin濃度を段階的に低濃度から高濃度に添加量を増やし、高濃度のapramycinに対して耐性を示す株を液体培養によって集積した結果、Cmlクラスターが増幅して巨大化したと推測されるSAP1が観察された。増幅されたpCML2を含むSAP1の存在比は極めて低かったが、Cmlの生産量はzouA非導入株の2倍程度(0.4g/L)まで増加した。一方で、zouA_RM04の場合では、pCML2をSAP1ベクター上への導入のみで、効率良くcmlが増幅された。
更に効率の良い遺伝子増幅効果を期待して、Cumateを誘導基質とした誘導型プロモーター(Pcmt：P21-cmt-CymRシステム)を用いた結果、cumate添加の有無にかかわらず、効率の良いpCML2の増幅が確認された。RM04株由来の野生型プロモーターを利用した当初の結果と比較しても顕著な増幅効果が見られたことから、今後はPcmtを利用することによって、効率の良い遺伝子増幅が期待できる。また、パルスフィールド電気泳動の結果、増幅された遺伝子領域は欠失することなく安定的に保持されており、観察できる限り、11コピーまで増幅されていた。

Research Products

• [Journal Article] Modifications to central carbon metabolism in an engineered Streptomyces host to enhance secondary metabolite production (2020)
  • Author(s): Doi Shiori、Komatsu Mamoru、Ikeda Haruo
  • Journal Title: Journal of Bioscience and Bioengineering Volume: 130 Issue: 6 Pages: 563-570
  • DOI: 10.1016/j.jbiosc.2020.08.006
  • NAID: 40022442999
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] In vitro Cas9-assisted editing of modular polyketide synthase genes to produce desired natural product derivatives (2020)
  • Author(s): Kudo Kei、Hashimoto Takuya、Hashimoto Junko、Kozone Ikuko、Kagaya Noritaka、Ueoka Reiko、Nishimura Takehiro、Komatsu Mamoru、Suenaga Hikaru、Ikeda Haruo、Shin-ya Kazuo
  • Journal Title: Nature Communications Volume: 11 Issue: 1 Pages: 1-12
  • DOI: 10.1038/s41467-020-17769-2
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] An Unusual Extender Unit Is Incorporated into the Modular Polyketide Synthase of Scopranones Biosynthesis (2019)
  • Author(s): Demachi Ayumu、Uchida Ryuji、Arima Shiho、Nagamitsu Tohru、Hashimoto Junko、Komatsu Mamoru、Kozone Ikuko、Shin-ya Kazuo、Tomoda Hiroshi、Ikeda Haruo
  • Journal Title: Biochemistry Volume: 58 Issue: 50 Pages: 5066-5073
  • DOI: 10.1021/acs.biochem.9b00908
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Presentation] 中心代謝改変による有用物質生産への応用 (2020)
  • Author(s): 土居志織、小松護、池田治生
  • Organizer: 日本農芸化学会2020年度大会