Analysis of the voltage-sensing phosphatase using voltage-clamp fluorometry

• Project/Area Number: 19K06585
• Research Category: Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
• Allocation Type: Multi-year Fund
• Section: 一般
• Review Section: Basic Section 43040:Biophysics-related
• Research Institution: Kagawa University
• Principal Investigator: Kawanabe Akira 香川大学, 医学部, 講師 (10707128)
• Project Period (FY): 2019-04-01 – 2023-03-31
• Project Status: Completed (Fiscal Year 2022)
• Budget Amount: ¥4,290,000 (Direct Cost: ¥3,300,000、Indirect Cost: ¥990,000); Fiscal Year 2021: ¥1,170,000 (Direct Cost: ¥900,000、Indirect Cost: ¥270,000); Fiscal Year 2020: ¥1,430,000 (Direct Cost: ¥1,100,000、Indirect Cost: ¥330,000); Fiscal Year 2019: ¥1,690,000 (Direct Cost: ¥1,300,000、Indirect Cost: ¥390,000)
• Keywords: 電位依存性ホスファターゼ / 電位依存性 / 脂質代謝酵素 / 電気生理学 / イオンチャネル / 蛍光変化解析 / パッチクランプ / 膜電位センサー / 電位依存性タンパク質 / 非天然蛍光アミノ酸 / Patch Clamp Fluorometry / イノシトールリン脂質 / 脱リン酸化酵素 / 電位センサー / ホスファターゼ / 電位依存性イオンチャネル

Outline of Research at the Start

細胞内シグナル伝達に重要な酵素群であるイノシトールリン脂質ホスファターゼ[PIPase: イノシトールリン脂質を脱リン酸化する酵素] が基質をどのように認識するのか・酵素活性をON/OFFにするのかなどの分子作用機序は不明であった。そこで本研究では、電位によって活性のON/OFFを制御可能な電位依存性ホスファターゼVSPを用いることで、酵素活性がONになる際の構造変化および、膜との距離変動を蛍光プローブを用いることで評価し、PIPaseに共通する動作原理を解明することを目的にしている。

Outline of Final Research Achievements

Inositol phospholipid phosphatases (PIPases) have important physiological functions. In this study, we aimed to clarify the mechanism of enzymatic activity of voltage-sensitive phosphatases (VSP, a type of PIPase) and to elucidate the common operating principle of PIPases. We analyzed local conformational changes from the fluorescence changes of VSPs with unnatural fluorescent amino acid (Anap), and suggested that the relative distance between "voltage sensor" and "enzyme region" changes during VSP activation, which affects the enzyme activity. Based on these results, we also produced functionally-enhanced VSPs.

Academic Significance and Societal Importance of the Research Achievements

細胞膜構成成分の1つであるイノシトールリン脂質 (PI) は、細胞膜上でシグナル伝達の役割も担い、生体の恒常性を維持するために重要である。PIの生理的機能を調整する酵素の1つがイノシトールリン脂質ホスファターゼ (PIPase) であるが分子機能の動作原理まで踏みんだ研究は進んでいない。その中で、われわれは機能解析と構造変化解析を組み合わせることで、動作機構を解明した。得られた知見は、PIPaseをターゲットとする臨床医学・創薬研究の基盤となると考えている。また、新規に作製した機能向上型VSPは、分子ツールとしてのさらなる活用が見込まれるため、研究分野の発展にも貢献できている。

Research Products

• [Int'l Joint Research] Weizmann Institute of Science/The Hebrew University of Jerusalem/Israel Institute of Technology(イスラエル)
• [Int'l Joint Research] Humboldt-Universit zu Berlin(ドイツ)
• [Journal Article] Rhodopsin-bestrophin fusion proteins from unicellular algae form gigantic pentameric ion channels (2022)
  • Author(s): Rozenberg A,Kaczmarczyk I,Matzov D,Vierock J,Nagata T,Sugiura M,Katayama K,Kawasaki Y,Konno M,Nagasaka Y,Aoyama M,Das I,Pahima E,Church J,Adam S,Borin VA,Chazan A,Augustin S,Wietek J,Dine J,Peleg Y,Kawanabe A,Fujiwara Y,Yizhar O,Sheves M,Schapiro I,Furutani Y,Kandori H,Inoue K,Hegemann P,Beja O,Shalev-Benami M.
  • Journal Title: Nature Structural & Molecular Biology Volume: 29 Issue: 6 Pages: 592-603
  • DOI: 10.1038/s41594-022-00783-x
  • Peer Reviewed / Int'l Joint Research
• [Journal Article] Interaction between S4 and the phosphatase domain mediates electrochemical coupling in voltage-sensing phosphatase (VSP) (2022)
  • Author(s): Mizutani Natsuki、Kawanabe Akira、Jinno Yuka、Narita Hirotaka、Yonezawa Tomoko、Nakagawa Atsushi、Okamura Yasushi
  • Journal Title: Proceedings of the National Academy of Sciences Volume: 119 Issue: 26 Pages: 2200364119-2200364119
  • DOI: 10.1073/pnas.2200364119
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] Intermolecular functional coupling between phosphoinositides and the potassium channel KcsA (2022)
  • Author(s): Kiya Takunari、Takeshita Kohei、Kawanabe Akira、Fujiwara Yuichiro
  • Journal Title: Journal of Biological Chemistry Volume: 298 Issue: 8 Pages: 102257-102257
  • DOI: 10.1016/j.jbc.2022.102257
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] Heterologous functional expression of ascidian Nav1 channels and close relationship with the evolutionary ancestor of vertebrate Nav channels (2021)
  • Author(s): Kawai Takafumi、Hashimoto Masaki、Eguchi Natsuki、Nishino Junko M.、Jinno Yuka、Mori-Kreiner Risa、Aspaker Mans、Chiba Daijiro、Ohtsuka Yukio、Kawanabe Akira、Nishino Atsuo S.、Okamura Yasushi
  • Journal Title: Journal of Biological Chemistry Volume: 296 Pages: 100783-100783
  • DOI: 10.1016/j.jbc.2021.100783
  • Peer Reviewed / Open Access / Int'l Joint Research
• [Journal Article] Engineering an enhanced voltage-sensing phosphatase (2020)
  • Author(s): Kawanabe Akira、Mizutani Natsuki、Polat Onur K.、Yonezawa Tomoko、Kawai Takafumi、Mori Masayuki X.、Okamura Yasushi
  • Journal Title: Journal of General Physiology Volume: 152 Issue: 5
  • DOI: 10.1085/jgp.201912491
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] The mechanoreceptor DEG-1 regulates cold tolerance in Caenorhabditis elegans (2020)
  • Author(s): Takagaki N., Ohta A., Ohnishi K., Kawanabe A., Minakuchi Y., Toyoda A., Fujiwara Y., Kuhara A.
  • Journal Title: EMBO reports Volume: 21 Issue: 3 Pages: 1-14
  • DOI: 10.15252/embr.201948671
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] Functional analysis of a double-point mutation in the KCNJ2 gene identified in a family with Andersen-Tawil syndrome (2019)
  • Author(s): Fukumura Shinobu、Yamauchi Kosuke、Kawanabe Akira、Yamamoto Akiyo、Nakaza Maki、Kubota Tomoya、Kato Shinsuke、Sasaki Ryogen、Okamura Yasushi、Takahashi Masanori P.
  • Journal Title: Journal of the Neurological Sciences Volume: 407 Pages: 116521-116521
  • DOI: 10.1016/j.jns.2019.116521
  • Peer Reviewed
• [Presentation] Mechanisms of voltage-depndent H+ channel activity regulated by membrane stretch and lipids (2023)
  • Author(s): Takata Maki, Kohei Takeshita, Akira Kawanabe, Yuichiro Fujiwara
  • Organizer: 第100回日本生理学会大会
• [Presentation] Functional regulation of phosphoinositides to the potassium channel KcsA (2023)
  • Author(s): Takunari Kiya, Kohei Takeshita, Akira Kawanabe, Yuichiro Fujiwara
  • Organizer: カリウムチャネルKcsAに対するイノシトールリン脂質の機能制御
• [Presentation] Direct interaction between the voltage-gated proton channel and ATP (2023)
  • Author(s): Akira Kawanabe, Maki Takata, Kohei Takeshita and Yuichiro Fujiwara
  • Organizer: 第100回日本生理学会大会
• [Presentation] ATPは電位依存性プロトンチャネルHv1に直接結合して活性を制御する (2022)
  • Author(s): 川鍋陽、竹下浩平、高田麻紀、藤原祐一郎
  • Organizer: 生理研研究会「構造情報を基盤とした膜機能分子の生理機能理解に向けて」
• [Presentation] カリウムチャネルKcsAとイノシトールリン脂質の分子間相互作用と機能修飾 (2022)
  • Author(s): 紀谷拓音、竹下浩平、川鍋陽、藤原祐一郎
  • Organizer: 生理研研究会「構造情報を基盤とした膜機能分子の生理機能理解に向けて」
• [Presentation] Intracellular ATP controls the voltage-gated proton channel (2022)
  • Author(s): Akira Kawanabe, Maki Takata and Yuichiro Fujiwara
  • Organizer: 第60回日本生物物理学会
• [Presentation] Toward an analysis of the effects of hydrogen sulfide on the voltage-gated potassium channel (2022)
  • Author(s): Akira Kawanabe and Yuichiro Fujiwara
  • Organizer: 4th International Conference on Persulfide and Sulfur Metabolism in Biology and Medicine
  • Int'l Joint Research
• [Presentation] The voltage-gated proton channel is regulated by ATP (2022)
  • Author(s): Akira Kawanabe, Maki Takata and Yuichiro Fujiwara
  • Organizer: 第99回日本生理学会大会
• [Presentation] カリウムチャネルとイノシトールリン脂質の分子間相互作用と機能修飾 (2022)
  • Author(s): 紀谷拓音、竹下浩平、川鍋陽、藤原祐一郎
  • Organizer: 2021（令和3）年度 生理研研究会 細胞の局所コミュニティ研究会
• [Presentation] 膜タンパク質の分子機構解析への 非天然蛍光アミノ酸の活用 (2021)
  • Author(s): 川鍋陽、坂田宗平、岡村康司
  • Organizer: 日本薬学会第141年会
  • Invited
• [Presentation] Cytoplasmic structural changes of voltage-sensing phosphatase detected by patch clamp fluorometry. (2021)
  • Author(s): Akira Kawanabe, Yuichiro Fujiwara
  • Organizer: 第98回日本生理学会大会
• [Presentation] 電位依存性プロトンチャネル活性に影響する細胞内分子 (2020)
  • Author(s): 川鍋陽、藤原祐一郎
  • Organizer: 生理学研究所研究会
• [Presentation] Intracellular regulation of the voltage-gated proton channel. (2020)
  • Author(s): Akira Kawanabe, Yuichiro Fujiwara
  • Organizer: 第58回日本生物物理学会年会
• [Presentation] 非天然蛍光アミノ酸を用いた膜タンパク質の動作メカニズム解析 (2020)
  • Author(s): 川鍋陽、米澤智子、神野有香、坂田宗平、岡村康司
  • Organizer: 日本薬学会第140年会
  • Invited
• [Presentation] The conformational change of the cytoplasmic region of voltage-sensing phosphatase (2020)
  • Author(s): Akira Kawanabe, Manami Nishizawa, Kazuhisa Nishizawa, Hirotaka Narita, Tomoko Yonezawa, Yuka Jinno, Souhei Sakata, Atsushi Nakagawa, Yasushi Okamura
  • Organizer: 第97回日本生理学会大会
  • Invited
• [Presentation] Improvement of voltage-sensing phosphatase as a molecular tool of phosphoinositide depletion in living cells (2019)
  • Author(s): Akira Kawanabe, Natuki Mizutani, Tomoko Yonezawa, Yasushi Okamura
  • Organizer: 第57回日本生物物理学会年会
• [Remarks] 香川大学医学部 分子生理学講座
  • URL: https://www.med.kagawa-u.ac.jp/~physiology1/index.html
• [Remarks] 香川大学医学部分子生理学講座Webページ
  • URL: http://www.med.kagawa-u.ac.jp/~physiology1/index.html
• [Remarks] 香川大学医学部分子生理学講座
  • URL: http://www.med.kagawa-u.ac.jp/~physiology1/index.html
• [Remarks] 香川大学医学部 分子生理学講座
  • URL: http://www.med.kagawa-u.ac.jp/~physiology1/index.html