ナノディスクに再構成した膜輸送体の1ユニット高速AFM動態解析

Research Project

Project/Area Number	19K06599
Research Category	Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
Allocation Type	Multi-year Fund
Section	一般
Review Section	Basic Section 43040:Biophysics-related
Research Institution	Nara Institute of Science and Technology
Principal Investigator	春山隆充奈良先端科学技術大学院大学, 先端科学技術研究科, 博士研究員 (10792202)
Project Period (FY)	2019-04-01 – 2020-03-31
Project Status	Discontinued (Fiscal Year 2019)
Budget Amount *help	¥4,420,000 (Direct Cost: ¥3,400,000、Indirect Cost: ¥1,020,000) Fiscal Year 2021: ¥910,000 (Direct Cost: ¥700,000、Indirect Cost: ¥210,000) Fiscal Year 2020: ¥910,000 (Direct Cost: ¥700,000、Indirect Cost: ¥210,000) Fiscal Year 2019: ¥2,600,000 (Direct Cost: ¥2,000,000、Indirect Cost: ¥600,000)
Keywords	高速原子間力顕微鏡 / 膜タンパク質 / ナノディスク / 一分子観察
Outline of Research at the Start	研究代表者らは、膜タンパク質を脂質二重膜環境下かつ水溶性状態で扱えるナノディスク技術とタンパク質の動態をリアルタイムで可視化できる高速原子間力顕微鏡法を組み合わせることで、従来では困難であった真横から膜タンパク質を観察する系を構築した。そこで本研究では、この測定法を応用して膜タンパク質による基質タンパク質の膜透過反応と膜タンパク質の立体構造変化を伴う分子の輸送反応をリアルタイムで可視化する。
Outline of Annual Research Achievements	膜タンパク質の高速原子間力顕微鏡(高速AFM)観察は、測定基板に展開した平面脂質二重膜中で行われてきた。申請者らは、新たにナノディスク技術を高速AFM法と組み合わせることで、従来では困難であった真横(膜表面が測定基板に対して垂直になる向き)から膜タンパク質を観察する系を構築した。この測定法は、膜タンパク質による物質の膜透過・膜輸送過程のリアルタイムでの可視化に応用できる。初めに、タンパク質の膜透過チャネルSecYEGによる基質タンパク質の膜透過反応の可視化に着手した。SecYEGとATP加水分解を伴って膜透過を駆動するSecA ATPaseを融合したタンパク質(SecYAEG)を再構成したナノディスク(SecYAEG-ND)は、マイカ基板上で横向きに配位する。当研究では、この横向きに配位したSecYAEG-NDが膜透過反応を伴って基板上を動く様子を高速AFMで観察する。動く様子を観察するにあたり、まず、基質タンパク質とSecYAEG-NDが相互作用した反応開始前の膜透過反応開始複合体を高速AFMで観察した。さらに、基質タンパク質がSecYEGの途中で停止した膜透過反応中間体と基質タンパク質が完全に膜透過してGFPによって反応が停止した膜透過反応終了複合体も観察した。それぞれの複合体でGFPとSecAの距離が異なっていることから、SecYAEG-NDでも基質タンパク質の膜透過反応が起こることが示唆された。また、ATP存在下で、膜透過反応中のSecAを高速AFMで詳細に観察したところ、SecAが構造変化する様子が見られた。研究期間全体(1年間)で、SecYAEG-NDが膜透過反応を行う様子を高速AFMで直接可視化できる系の構築を達成した。