Redox sensing by membrane proteins via cysteine residues in the TM region as studied by using solution NMR

Research Project

Project/Area Number	19K07040
Research Category	Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
Allocation Type	Multi-year Fund
Section	一般
Review Section	Basic Section 47020:Pharmaceutical analytical chemistry and physicochemistry-related
Research Institution	The University of Tokyo (2021) National Institute of Advanced Industrial Science and Technology (2019-2020)
Principal Investigator	Tokunaga Yuji 東京大学, 大学院薬学系研究科(薬学部), 助教 (80713354)
Co-Investigator(Kenkyū-buntansha)	坂倉正義横浜市立大学, 生命医科学研究科, 助教 (20334336) 鴫直樹国立研究開発法人産業技術総合研究所, 生命工学領域, 主任研究員 (20392623)
Project Period (FY)	2019-04-01 – 2022-03-31
Project Status	Completed (Fiscal Year 2021)
Budget Amount *help	¥4,290,000 (Direct Cost: ¥3,300,000、Indirect Cost: ¥990,000) Fiscal Year 2021: ¥1,430,000 (Direct Cost: ¥1,100,000、Indirect Cost: ¥330,000) Fiscal Year 2020: ¥1,430,000 (Direct Cost: ¥1,100,000、Indirect Cost: ¥330,000) Fiscal Year 2019: ¥1,430,000 (Direct Cost: ¥1,100,000、Indirect Cost: ¥330,000)
Keywords	タンパク質 / システイン残基 / 過硫化 / tRNA修飾 / 核磁気共鳴 / 高分子量観測 / NMR / システイン / 硫黄修飾 / 高分子量タンパク質 / 重水素化 / 硫黄運搬 / 硫黄化修飾 / 構造平衡 / レッドクス修飾 / 膜タンパク質 / 膜貫通領域 / レドックス修飾 / 溶液NMR法
Outline of Research at the Start	膜タンパク質の膜貫通領域のシステインは、安定性に寄与しにくく役割は謎である。本研究では、当該システインが細胞内外のレドックスセンサーとして働く仮説を立て、実験的に検証する。このために、嫌気環境下でシステインの修飾状態を安定に制御した試料を調製し、溶液NMR法にて無侵襲に残基分解能の構造情報を取得する独自のアプローチを確立し、取扱いの難しい膜タンパク質のシステイン修飾状態を解析可能とする。このアプローチを、近年、膜貫通領域システインのレドックス修飾に基づく機能制御が報告されたアクアポリン８に適用することで、酸素と硫黄、原子１個の修飾の違いが、チャネル機能を逆方向に制御する構造機構を解明する。
Outline of Final Research Achievements	We developed an NMR technique, 15N-direct detection CRINEPT, which enables observation of backbone amide signals of non-deuterated high molecular weight proteins with an unprecedentedly high sensitivity. By using 15N CRINEPT, we successfuly observed amide 1H-15N resonances from more than 80% Ala residues of an analogue of a therapeutic monoclonal antibody in formulation at a storage temperature of 4 deg. This technique is also fundamental to the analyses of redox sensing mechanisms by membrane proteins reconstituted in a lipid bilayer. We also investigated the structural change of an E. coli protein, TusE, which works as a member of sulfur transfer cascade from L-cysteine to tRNA. Persulfidation of TusE on Cys108 residue, where the cargo sulfur atom is attached to the sidechain of Cys108 to form the -SSH group, induced substantial structural change of TusE, leading to protection of the sulfur atom from passive oxidation for high-efficiency sulfer transfer.
Academic Significance and Societal Importance of the Research Achievements	本研究で開発した15N CRINEPT法は、溶液NMR法の最大の課題である高分子量限界を大幅に改善するとともに、従来は解析が困難であった重水素化できないタンパク質にも適用範囲を持つため、膜タンパク質のレドックス感知機構の解明のみならず、基礎研究および創薬分野に幅広く波及効果をもたらす極めて普遍性の高い技術的進歩として有意義である。 TusEを対象としたNMR解析から明らかとされた硫化に伴う合目的的な構造変化は、化学的な安定性の低い硫黄修飾を介した情報伝達に対して頑強性をもたらす機構と捉えることができ、近年脚光を浴び始めた生体内の超硫黄分子群の制御を研究する上での先駆的な知見となる。