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Development of high-throughput histidine kinase assay for drug discovery

Research Project

Project/Area Number 19K07147
Research Category

Grant-in-Aid for Scientific Research (C)

Allocation TypeMulti-year Fund
Section一般
Review Section Basic Section 47050:Environmental and natural pharmaceutical resources-related
Research InstitutionHiroshima Bunkyo University (2021)
Hiroshima University (2019-2020)

Principal Investigator

Eiji Kinoshita  広島文教大学, 人間科学部, 教授 (80304418)

Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) 江口 陽子  近畿大学, 生物理工学部, 准教授 (30757422)
Project Period (FY) 2019-04-01 – 2022-03-31
Project Status Completed (Fiscal Year 2021)
Budget Amount *help
¥4,290,000 (Direct Cost: ¥3,300,000、Indirect Cost: ¥990,000)
Fiscal Year 2021: ¥1,300,000 (Direct Cost: ¥1,000,000、Indirect Cost: ¥300,000)
Fiscal Year 2020: ¥1,430,000 (Direct Cost: ¥1,100,000、Indirect Cost: ¥330,000)
Fiscal Year 2019: ¥1,560,000 (Direct Cost: ¥1,200,000、Indirect Cost: ¥360,000)
Keywordsフォスタグ / リン酸化タンパク質 / ヒスチジンキナーゼ / ヒスチジンキナーゼ阻害剤 / waldiomycin / Phos-tag Aqua / ドットブロット法 / Phos-tag Magenta / Phos-tag Cyan / 蛍光ゲル染色剤 / リン酸化 / 2成分系 / 情報伝達分子
Outline of Research at the Start

近年,細菌に特有の2成分情報伝達分子であるヒスチジンキナーゼを標的とした抗菌薬の探索が国内外で進められている。ヒスチジンのリン酸化を介して生理活性を担うこの分子は,ヒスチジンのリン酸結合の脆弱性のために分析法が限られていた。申請者らは,独自に開発したリン酸基捕捉分子,フォスタグを用いたヒスチジンキナーゼのリン酸化定量電気泳動法を考案しており,本法はキナーゼ阻害剤のプロファイリングにも有用である。また,ヒスチジンキナーゼ阻害剤として有能な低分子化合物も幾つか見出している。そこで本研究では,それらを基盤とすることで,ハイスループット性を加味した新たなヒスチジンキナーゼアッセイ法を創出する。

Outline of Final Research Achievements

The principal investigator newly synthesized several fluorophore-labeled Phos-tag derivatives and succeeded in phosphorylation profiling of histidine-phosphorylated proteins (histidine kinases) derived from bacteria by using the fluorophore-labeled Phos-tag derivatives as gel stains after SDS-PAGE analysis. This novel Phos-tag dye technology is suitable for the quantitative monitoring of histidine- and aspartate-phosphorylated proteins in bacterial signaling systems, and it can be applied directly on SDS-PAGE gels. Furthermore, as a result of attempting to detect phosphorylated proteins on the blot membrane using Phos-tag Aqua, which is one of the Phos-tag fluorescent gel stains, bacterial histidine kinases dot-blotted on the membrane were selectively visualized. This simple dot-blotting method using Phos-tag Aqua developed in this study has been demonstrated to be useful for high-throughput histidine kinase assays and high-throughput screening of bacterial histidine kinase inhibitors.

Academic Significance and Societal Importance of the Research Achievements

感染症治療薬について,病原菌特有のヒスチジンキナーゼ阻害薬が,次世代の抗生物質として注目されつつある。しかし,病原菌のヒスチジンキナーゼは化学的に不安定で短寿命なリン酸化タンパク質を生成する性質があり,阻害薬としての候補化合物を検証する方法が限られていた。本研究では,そのような不安定なリン酸化タンパク質を高感度に定量分析するための蛍光標識型分子デバイスを創出し,それを応用することで,病原菌特有のヒスチジンキナーゼ阻害薬を探索すべく多検体処理能力に秀でた高速スクリーニングシステム開発の可能性を証明できたことはとても意義深い。本手法が今後のこの分野におけるブレイクスルーになることを期待する。

Report

(4 results)
  • 2021 Annual Research Report   Final Research Report ( PDF )
  • 2020 Research-status Report
  • 2019 Research-status Report
  • Research Products

    (39 results)

All 2021 2020 2019 Other

All Journal Article (14 results) (of which Peer Reviewed: 14 results,  Open Access: 12 results) Presentation (21 results) (of which Invited: 7 results) Book (3 results) Remarks (1 results)

  • [Journal Article] An assay of human tyrosine protein kinase ABL activity using an Escherichia coli protein expression system.2021

    • Author(s)
      Kinoshita-Kikuta E, Yoshimoto M, Yano M, Eiji Kinoshita, Koike T.
    • Journal Title

      Biotechniques

      Volume: 70(4) Issue: 4 Pages: 209-217

    • DOI

      10.2144/btn-2020-0154

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    • Author(s)
      Okawara, Y., Hirano, H., Kimura, A., Sato, N., Hayashi, Y., Osada, M., Kawakami, T., Ootake, N., Eiji Kinoshita, Fujita, K.
    • Journal Title

      J. Proteomics

      Volume: 231 Pages: 104005-104005

    • DOI

      10.1016/j.jprot.2020.104005

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    • Author(s)
      Kinoshita-Kikuta E, Eiji Kinoshita, Suga M, Higashida M, Yamane Y, Nakamura T, Koike T.
    • Journal Title

      Biomolecules

      Volume: 11(10) Issue: 10 Pages: 1448-1448

    • DOI

      10.3390/biom11101448

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  • [Journal Article] Characterization of the binding of adenosine-5’-monophosphate to a mu-type alkoxide-linked dinuclear zinc(II) complex in crystal and solution state.2021

    • Author(s)
      Kinoshita-Kikuta, E., Ichimaru, Y., Yamano, Y., Kato, K., Kurosaki, H. Eiji Kinoshita, Koike, T.
    • Journal Title

      Bull. Chem. Soc. Jpn.

      Volume: 94(11) Issue: 11 Pages: 2670-2677

    • DOI

      10.1246/bcsj.20210280

    • NAID

      130008137574

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    • Author(s)
      Ichimaru, Y., Kato, K., Jin W., Sugiura K., Kinoshita-Kikuta E., Eiji Kinoshita, Kurosaki H., Koike T.
    • Journal Title

      X-ray Struct. Anal.

      Volume: 37 Issue: 3 Pages: 87-88

    • DOI

      10.1107/s2056989022001530

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    • Author(s)
      Sogame Yoichiro、Kojima Katsuhiko、Takeshita Toshikazu、Kikuchi Shiho、Shimada Yuto、Nakamura Rikiya、Arikawa Mikihiko、Miyata Seiji、Kinoshita Eiji、Suizu Futoshi、Matsuoka Tatsuomi
    • Journal Title

      Acta Protozoologica

      Volume: 59 Issue: 3-4 Pages: 107-120

    • DOI

      10.4467/16890027ap.20.009.13264

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      Kinoshita-Kikuta Emiko、Maruta Shino、Eguchi Yoko、Igarashi Masayuki、Okajima Toshihide、Utsumi Ryutaro、Kinoshita Eiji、Koike Tohru
    • Journal Title

      Analytical Biochemistry

      Volume: 600 Pages: 113765-113765

    • DOI

      10.1016/j.ab.2020.113765

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    • Author(s)
      Tsunehiro Masaya、Sasaki Kenji、Kinoshita-Kikuta Emiko、Kinoshita Eiji、Koike Tohru
    • Journal Title

      Journal of Chromatography B

      Volume: 1151 Pages: 122198-122198

    • DOI

      10.1016/j.jchromb.2020.122198

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    • Author(s)
      Kinoshita-Kikuta Emiko、Utsumi Toshihiko、Miyazaki Aya、Tokumoto Chiharu、Doi Kyosuke、Harada Haruna、Kinoshita Eiji、Koike Tohru
    • Journal Title

      Scientific Reports

      Volume: 10 Issue: 1 Pages: 16273-16273

    • DOI

      10.1038/s41598-020-73248-0

    • NAID

      120007169771

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  • [Journal Article] A dot-blot-staining method for detecting phosphoproteins with a Phos-tag Aqua fluorescent dye2020

    • Author(s)
      Kinoshita-Kikuta Emiko、Akayama Keisuke、Kinoshita Eiji、Koike Tohru
    • Journal Title

      Journal of Electrophoresis

      Volume: 64 Issue: 1 Pages: 7-11

    • DOI

      10.2198/jelectroph.64.7

    • NAID

      130007961315

    • ISSN
      1349-9394, 1349-9408
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  • [Journal Article] Quantitative analysis of phosphoproteins in a bacterial two-component system using Phos-tag techniques2020

    • Author(s)
      Kinoshita-Kikuta Emiko、Kinoshita Eiji、Koike Tohru
    • Journal Title

      Electrophoresis Letters

      Volume: 64 Issue: 1 Pages: 35-39

    • DOI

      10.2198/electroph.64.35

    • NAID

      130007871304

    • ISSN
      2189-2628, 2189-2636
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    • Author(s)
      Hiroshi Kusamoto, Emiko Kinoshita-Kikuta, Tomoyo Nishimura, Tomomi Nagai, Eiji Kinoshita, and Tohru Koike,
    • Journal Title

      Journal of Electrophoresis

      Volume: 63 Issue: 1 Pages: 25-32

    • DOI

      10.2198/jelectroph.63.25

    • NAID

      130007634033

    • ISSN
      1349-9394, 1349-9408
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    • Author(s)
      Emiko Kinoshita-Kikuta, Hiroshi Kusamoto, Syogo Ono, Keisuke Akayama, Yoko Eguchi, Masayuki Igarashi, Toshihide Okajima, Ryutaro Utsumi, Eiji Kinoshita, Tohru Koike
    • Journal Title

      Electrophoresis

      Volume: 40 Issue: 22 Pages: 3005-3013

    • DOI

      10.1002/elps.201900261

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  • [Journal Article] A strategy to identify protein-N-myristoylation-dependent phosphorylation reactions of cellular proteins by using Phos-tag SDS-PAGE.2019

    • Author(s)
      Emiko Kinoshita-Kikuta, Ayane Tanikawa, Takuro Hosokawa, Aya Kiwado, Koko Moriya, Eiji Kinoshita, Tohru Koike, Toshihiko Utsumi
    • Journal Title

      PLOS ONE

      Volume: 14 Issue: 11 Pages: e0225510-e0225510

    • DOI

      10.1371/journal.pone.0225510

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      Kinoshita-Kikuta, E., Eiji Kinoshita, Koike, T.
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      Springer Nature
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      Eiji Kinoshita, Kinoshita-Kikuta, E., Koike, T.
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      Springer Nature
    • ISBN
      9781493996612
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      http://phostag.hiroshima-u.ac.jp/

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URL: 

Published: 2019-04-18   Modified: 2023-01-30  

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