Gene therapy for FAP using TTR exon-humanized mouse

• Project/Area Number: 19K07354
• Research Category: Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
• Allocation Type: Multi-year Fund
• Section: 一般
• Review Section: Basic Section 48040:Medical biochemistry-related
• Research Institution: Kumamoto University
• Principal Investigator: Li Zhenghua 熊本大学, 生命資源研究・支援センター, 客員准教授 (80398239)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 山村 研一 熊本大学, 生命資源研究・支援センター, 客員教授 (90115197)
• Project Period (FY): 2019-04-01 – 2022-03-31
• Project Status: Completed (Fiscal Year 2021)
• Budget Amount: ¥4,290,000 (Direct Cost: ¥3,300,000、Indirect Cost: ¥990,000); Fiscal Year 2021: ¥1,040,000 (Direct Cost: ¥800,000、Indirect Cost: ¥240,000); Fiscal Year 2020: ¥1,560,000 (Direct Cost: ¥1,200,000、Indirect Cost: ¥360,000); Fiscal Year 2019: ¥1,690,000 (Direct Cost: ¥1,300,000、Indirect Cost: ¥390,000)
• Keywords: 家族性アミロイドポリニューロパチー / トランスサイレチン / 優性遺伝病 / CRISPR/Cas9 / 遺伝子治療 / CRSIPR/Cas9

Outline of Research at the Start

家族性アミロイドポリニューロパチーは、トランスサイレチン遺伝子の点突然変異により引き起こされる典型的なヒト優性遺伝病である。治療法としては、肝臓移植やTTRの安定化剤が開発されてきたが、期待するほどの効果は上がっていない。一方、低分子干渉RNA(siRNA)やアンチセンスオリゴヌクレオチド(ASO)を用いると、肝臓内でのTTR遺伝子の発現量が75-80%低下し、末梢神経障害も有意に改善することが報告された。そこで、CRISPR/Cas9法を用いて、マウスモデルの肝臓内のヒト変異TTR遺伝子を破壊するという新しい概念の遺伝子治療が可能かどうかを検証する。

Outline of Final Research Achievements

To make an ideal mouse model for a human genetic disease, familial amyloidotic polyneuropathy (FAP), we first produced a wild-type TTR exon-humanized mouse (TtrhV30exon) in which only mouse exons, but not introns, were replaced with human corresponding exons, using genome editing technology. Then, we produced a mutant TTR exon-humanized mouse (TtrhM30exon) using fertilized eggs of TtrhV30exon. These TTR exon-humanized mice showed completely normal TTR expression patterns, in terms of serum TTR level, spatial-specificity, and temporal-specificity. We then injected 50μg of AAV-gRNA-TTR-SaCas9 containing gRNA into exon-humanized mice using hydrodynamic tail vein injection. In 3 out of 8 mice, serum TTR levels decreased to 50%. These exon-humanized mice will be useful for verifying a new way of treatment for FAP.

Academic Significance and Societal Importance of the Research Achievements

新しい治療法の開発には、ヒトでの遺伝子発現パターンを再現し、ヒト疾患の病態を忠実に反映するマウスモデルが必要であるが意外に困難である。ここで開発したTTR エクソンヒト化マウスでは、これらの問題点を克服することができ、学術的な意義は大きい。ここでのターゲット遺伝子はTTRであり小さく、通常のプラスミドベクターで目的を達成できたが、より大きな遺伝子の場合は、コスミッドベクターや人工細菌染色体等を用いればよく、それにより多くの遺伝子のエクソンヒト化マウスを作製できる道を開くことができ、それを新しい治療法、殊に遺伝子治療法、の開発と検証に応用できるため社会的意義も大きい。

Research Products

• [Int'l Joint Research] Harbin Medical University(中国)
• [Journal Article] TTR exon-humanized mouse optimal for verifying new therapies for FAP (2022)
  • Author(s): Li Z, Kanazashi H, Tokashiki Y, Fujikawa R, Okagaki A, Katoh S, Kojima K, Haruna K, Matsushita N, Ishikawa TO, Chen H, Yamamura K.
  • Journal Title: Biochem Biophys Res Commun. Volume: 599 Pages: 6974-6974
  • DOI: 10.1016/j.bbrc.2022.02.035
  • Peer Reviewed / Int'l Joint Research
• [Journal Article] Dissecting pathophysiology of a human dominantly inherited disease, familial amyloidotic polyneuropathy, by using genetically engineered mice. (2022)
  • Author(s): Li Z, Yamamura K.
  • Journal Title: Frigid Zone Med Volume: in press
  • Peer Reviewed
• [Presentation] エクソンヒト化による治療法開発に最適なFAPモデルマウスの開 (2020)
  • Author(s): 李正花、金指英樹、加藤洋教、渡嘉敷佳美、藤川理恵、岡垣郁香、加藤翔、小島健太、春名享子、松下直子、熊ノ郷晴子、品川真吾、石川智夫、山村研一
  • Organizer: 日本分子生物学会年会