| Project/Area Number |
19K07513
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| Research Category |
Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
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| Allocation Type | Multi-year Fund |
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| Section | 一般 |
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| Review Section |
Basic Section 49030:Experimental pathology-related
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| Research Institution | Dokkyo Medical University |
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Principal Investigator |
伊藤 雅彦 獨協医科大学, 医学部, 准教授 (70270486)
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| Project Period (FY) |
2019-04-01 – 2025-03-31
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| Project Status |
Granted (Fiscal Year 2023)
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| Budget Amount *help |
¥4,290,000 (Direct Cost: ¥3,300,000、Indirect Cost: ¥990,000)
Fiscal Year 2022: ¥910,000 (Direct Cost: ¥700,000、Indirect Cost: ¥210,000)
Fiscal Year 2021: ¥1,170,000 (Direct Cost: ¥900,000、Indirect Cost: ¥270,000)
Fiscal Year 2020: ¥1,170,000 (Direct Cost: ¥900,000、Indirect Cost: ¥270,000)
Fiscal Year 2019: ¥1,040,000 (Direct Cost: ¥800,000、Indirect Cost: ¥240,000)
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| Keywords | 肝細胞 / 胆汁うっ滞 / PFIC / 毛細胆管バリア / タイトジャンクション / ZO-1 / ZO-2 / 脂肪肝 / 肝臓 / 胆汁鬱滞 / 血管内皮 / 上皮組織バリア / 臓器機能 / 栄養代謝 / 炎症老化 / 生体内ネットワーク |
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| Outline of Research at the Start |
組織バリアの存在は多細胞生物の正常な生命活動に極めて重要である。本研究では、組織バリアの重要な構成要素である上皮細胞間Tight Junctionに焦点を当て、その形成・維持に必須なZO family分子を組織特異的に欠損するマウスの解析を中心に、特定の臓器においてバリアが破綻した際に各々の臓器の組織構築・生理機能・分子発現がどのように変化するか、特定臓器のバリア破綻が他臓器や全身性にどのような影響を及ぼすか明らかにする。
さらに、栄養やエネルギー代謝および炎症や老化といった現象とバリア制御の関係性について検討し、どのような物質や生活環境因子が組織バリアを障害するのか解明する。
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| Outline of Annual Research Achievements |
近年、上皮バリアの基盤であるタイトジャンクションの構成分子の変異が関連するヒト遺伝性疾患の報告が増加しています。その中で、進行性家族性肝内胆汁うっ滞症（PFIC）の一種であるPFIC4の原因遺伝子が、タイトジャンクション構成分子ZO-2であることが明らかになりました。ZO-2は上皮バリアの調節に関与するタンパク質複合体を形成しますが、肝細胞におけるZO-2の欠損が、この疾患の病態とどのように関連しているかはまだ十分に解明されていません。そこで、本研究ではマウスモデルを用いてこの問題にアプローチしました。
先行研究では、ZO-2を全身的に欠損させたマウスは胎生10日前後で致死となり、肝臓の変化を解析することが困難でした。そのため、ZO-2 floxedマウスとAlbumin-Creトランスジェニックマウスを交配し、肝臓特異的にZO-2を欠損させたマウスを作製しました。これらのマウスは軽度の胆汁うっ滞を示しましたが、PFIC4患者のような重篤な状態には至りませんでした。その理由として、ZO-2に類似した一次構造を持つ分子ZO-1が機能を代替している可能性が考えられました。そこで、ZO-2とZO-1を同時に肝臓特異的に欠損させたマウス(L-DKOマウス)を作製しました。このL-DKOマウスは胆汁うっ滞と共に成長障害を示し、６週齢までに全個体が死亡しました。また、肝小葉構造が不明瞭になり、毛細胆管構造に異常が起きるなど、PFIC4患者の肝臓に類似した特徴を示すことが明らかになりました。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
これまでの組織レベルの解析から、ZO-2とZO-1の両分子を同時に欠損する肝臓では、肝細胞索構造と類洞の配置の乱れが生じ、E-cadherin陽性のzone1が拡張する一方で、zone3を特徴づけるグルタミン合成酵素陽性細胞が減少するなど、zonationが変化することが明らかになっています。免疫染色解析によれば、タイトジャンクション構成分子の局在異常だけでなく、毛細胆管への物質排出に関わるトランスポーターがapical膜へ局在化できない変化が起きていました。電子顕微鏡による微細構造解析では、本来は肝細胞のapical側に位置する毛細胆管が不規則に配置され、異常な形態を示すことが明らかになりました。また、細胞内ではvacuoleの出現やミトコンドリアの膨潤などの異常も認められました。
こうした変化の分子レベルの基盤を網羅的に明らかにするために、２週齢のコントロールマウスおよびL-DKOマウスの肝臓からRNAを精製し、RNA-seqによるトランスクリプトーム解析を行いました。その結果、活性化している経路として、抗酸化ストレス応答、解毒代謝経路、コレステロール合成経路などが挙げられました。一方、抑制されている経路として、肝細胞分化経路、脂肪酸代謝経路、炎症反応経路などが挙げられました。
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| Strategy for Future Research Activity |
トランスクリプトーム解析データについてより詳細な検討を進め、活性化および抑制されている経路の中で具体的に大きな変化を示す遺伝子をリストアップします。遺伝子の発現パターンや関連する生化学的経路を網羅的に評価し、変化の傾向を明確に把握します。次に、リストアップした遺伝子が、いつから・どの程度の変化を示すかを定量PCRによって解析します。そのために、floxedマウスとAlbumin-Creマウスの交配によってZO-2とZO-1のタンパク質がいつから減少しているかをまず明らかにします。Albumin-CreはE15から発現するとされていることから、E15以降の胚から肝臓を取り出して解析します。また、P0、P1、P4、P7、P10と２週齢までの間のいくつかのポイントでコントロールマウスおよびL-DKOマウスの肝臓からRNAを精製し、胚由来のサンプルと合わせて定量PCRを行います。この実験により、遺伝子発現の変化が時間経過とともにどのように進行しているかを詳細に把握し、活性化および抑制されている経路の間の因果関係をできるだけ明らかにしていきたいと考えています。
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