全ゲノム配列を用いたトキソプラズマ分子疫学情報の解明と病原性関連遺伝子の同定

• Project/Area Number: 19K07520
• Research Category: Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
• Allocation Type: Multi-year Fund
• Section: 一般
• Review Section: Basic Section 49040:Parasitology-related
• Research Institution: Chiba University
• Principal Investigator: 野呂瀬 一美 千葉大学, 大学院医学研究院, 特任准教授 (30156244)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 彦坂 健児 千葉大学, 大学院医学研究院, 講師 (30456933) ; 新庄 記子 千葉大学, 大学院医学研究院, 特任助教 (60794039) ; 関根 章博 千葉大学, 予防医学センター, 教授 (30425631)
• Project Period (FY): 2019-04-01 – 2022-03-31
• Project Status: Granted (Fiscal Year 2019)
• Budget Amount: ¥4,290,000 (Direct Cost: ¥3,300,000、Indirect Cost: ¥990,000); Fiscal Year 2021: ¥910,000 (Direct Cost: ¥700,000、Indirect Cost: ¥210,000); Fiscal Year 2020: ¥780,000 (Direct Cost: ¥600,000、Indirect Cost: ¥180,000); Fiscal Year 2019: ¥2,600,000 (Direct Cost: ¥2,000,000、Indirect Cost: ¥600,000)
• Keywords: トキソプラズマ / ゲノム / 次世代シーケンサー / 分子疫学 / 薬剤耐性 / トキソプラズマ症 / 全ゲノム配列 / 病原性

Outline of Research at the Start

トキソプラズマ特異的遺伝子を標的としたPCR法で陽性を示した臨床検体を用いて次世代シーケンサーにより全ゲノムを解読し、さらに目的遺伝子を標的としたシーケンス法で遺伝子型別感染状況を明らかにする。また、新規検体はin vivo/in vitro培養よりトキソプラズマ臨床株を樹立し、動物感染実験による病原性発症機序・薬剤感受性・薬剤による遺伝子変異を解明する。これらの情報と病歴を照合し新規病原性関連遺伝子を同定しトキソプラズマの診断・病原性に関わる遺伝子情報の研究基盤を構築する。

Outline of Annual Research Achievements

日和見感染症のトキソプラズマ症は細胞内寄生原虫であるトキソプラズマの感染により引き起こされ、全世界の約三分の一がこの原虫に感染している。トキソプラズマ症は人獣共通寄生虫症であり、世界的に新株や強毒株、薬剤耐性株の存在が判明している。しかし、島国である本邦におけるヒトに感染するトキソプラズマに関する分子疫学情報（遺伝子型・全ゲノム配列・病原性・薬剤耐性の原因変異等）は未解明のまま残されている。
この研究の目的は、本邦におけるトキソプラズマ症の分子疫学情報を整備し、さらに病歴情報と照合することで病原性に関与する株間の遺伝子変異を特定することにある。今年度の実績を以下に列記する。
１．トキソプラズマ患者から分離した株をインターフェロンガンマノックアウトマウス由来胎児繊維芽細胞やベロ細胞に接種し限界希釈法でトキソプラズマのクローンを２株作成した。
２．全国からトキソプラズマ症の診断目的で送付されてきた臨床検体（羊水、髄液、末梢血、脳組織、臍帯、等）から、ＤＮＡを抽出しＰＣＲ法でトキソプラズマ遺伝子が陽性と判断された検体をインターフェロンガンマノックアウトマウスの腹腔内や経口的に感染させ、株の樹立を図った。
３．過去にＰＣＲ法でトキソプラズマ陽性と判断された臨床検体を順次、各種のプライマーを使用して遺伝子型の分析をしている。さらにそれらの遺伝子型と病歴・臨床経過を比較・照合し、病原性に関与する遺伝子情報の研究基盤を構築しつつある。

Current Status of Research Progress

3: Progress in research has been slightly delayed.

Reason

１．臨床株からの限界希釈法によるクローンの確立に時間がかかった。
２．臨床株から樹立したトキソプラズマの数クローンの全ゲノム配列をPackBio RS II/Sequelで解析しようとしたが、機器の故障により現在までに解析ができていない。
３．インターフェロンノックアウトマウスに腹腔内や経口接種したが、まだ株の樹立にまでは至っていない。

Strategy for Future Research Activity

PackBio RS II/Sequelの修理が終わったら直ちに既に確立したクローンを用いて全ゲノムの解読を予定している。
引き続き今年度と同様に次年度以降も、全国から送付されてくるトキソプラズマ感染が疑われる患者の臨床検体から、ＰＣＲ法でその遺伝子の有無を解析し、遺伝子が確認された検体はインターフェロンガンマノックアウトマウスに接種したりin vitroで培養し、患者個別の株を樹立し、その病歴と照合することにより、病原性・薬剤耐性等を解析する。

Research Products

• [Journal Article] Berberine for Prevention of Dementia Associated With Diabetes and Its Comorbidities: A Systematic Review (2020)
  • Author(s): Shinjyo N, Parkinson J, Bell J, Katsuno T, Bligh A
  • Journal Title: J Integr Med Volume: 18 Pages: 125-151
  • DOI: 10.1016/j.joim.2020.01.004
  • Peer Reviewed / Int'l Joint Research
• [Journal Article] Pseudo-‘Pneumatosis intestinalis’ sign: A case of parasite uniquely depicted on postmortem CT. (2020)
  • Author(s): Yoshida M, Hoshioka Y, Makino Y, Kojima M, Horikoshi T, Mukai H, Hikosaka K, Norose K, Iwase H.
  • Journal Title: Forensic Imaging Volume: 20 Pages: 1-5
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Hypericum Erectum Alcoholic Extract Inhibits Toxoplasma Growth and Entamoeba Encystation: An Exploratory Study on the Anti-Protozoan Potential (2020)
  • Author(s): Shinjyo N, Nakayama H, Ishimaru K, Hikosaka K, Mi-Ichi F, Norose K, Yoshida H.
  • Journal Title: J Nat Med. Volume: 74 Pages: 294-305
  • DOI: 10.1007/s11418-019-01369-6
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Desensitization to trimethoprim-sulfamethoxazole in a toxoplasmic encephalitis patient who was intolerant to conventional treatments. (2020)
  • Author(s): Miyata N, Yoshimura Y, Hikosaka K, Norose K, Tachikawa N.
  • Journal Title: J Infect Chemother Volume: 26 Pages: 289-293
  • DOI: 10.1016/j.jiac.2019.10.008
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Genetic polymorphisms in malaria vaccine candidate Plasmodium falciparum reticulocyte-binding protein homologue-5 among populations in Lagos, Nigeria. (2020)
  • Author(s): Ajibaye O, Osuntoki AA, Balogun EO, Olukosi YA, Iwalokun BA, Oyebola KM, Hikosaka K, Watanabe YI, Ebiloma GU, Kita K, Amambua-Ngwa A.
  • Journal Title: Malaria Journal Volume: 19 Pages: 6-6
  • DOI: 10.1186/s12936-019-3096-0
  • Peer Reviewed / Open Access / Int'l Joint Research
• [Journal Article] Single-molecular real-time deep sequencing reveals the dynamics of multi-drug resistant haplotypes and structural variations in the hepatitis C virus genome. (2020)
  • Author(s): Yamashita T, Takeda H, Takai A, Arasawa S, Nakamura F, Mashimo Y, Hozan M, Ohtsuru S, Seno H,Ueda Y, Sekine A
  • Journal Title: Sci Rep Volume: 10 Pages: 2651-2651
  • DOI: 10.1038/s41598-020-59397-2
  • Peer Reviewed / Open Access / Int'l Joint Research
• [Journal Article] Age-Associated Changes in Value of the National Early Warning Score with the Japanese-Modified Glasgow Prognostic Score (NEWS-JmGPS) for Predicting In-Hospital Mortality of Elderly Patients Visiting the Emergency Department. (2020)
  • Author(s): Mitsunaga T, Hasegawa I, Uzura M, Okuno K, Sekine A, Takeda S.
  • Journal Title: Arch Clinical Biomed Res Volume: 4 Pages: 001-016
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Association of HLA-A*11:01 with Sulfonamide-Related Severe Cutaneous Adverse Reactions in Japanese Patients (2020)
  • Author(s): Nakamura R, Ozeki T, Hirayama N, Sekine A, Yamashita T, Mashimo Y, Mizukawa Y, Shiohara T, Watanabe H, Sueki H, Ogawa K, Asada H, Kaniwa N, Tsukagoshi E, Matsunaga K, Niihara H, Yamaguchi Y, Aihara M, Mushiroda T, Saito Y, Morita E
  • Journal Title: Journal of Investigative Dermatology Volume: - Pages: 30040-30043
  • DOI: 10.1016/j.jid.2019.12.025
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Toxoplasmosis-associated central nervous system vasculitis accompanied by multiple cerebral hemorrhages developing subsequent to cord blood transplantation (2019)
  • Author(s): 太田 貴徳, 今永 博, 奥 誠道, 楠元 大岳, 杉尾 康浩, 田宮 貞史, 久保 安孝, 小川 亮介, 彦坂 健児, 野呂瀬 一美, 大野 裕樹
  • Journal Title: Jpn. J. Clin. Hematol. Volume: 60 Issue: 2 Pages: 118-123
  • DOI: 10.11406/rinketsu.60.118
  • NAID: 130007607569
  • ISSN: 0485-1439, 1882-0824
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Metastatic Malignant Lymphoma Mimicking Cerebral Toxoplasmosis with the "Target Sign". (2019)
  • Author(s): Ueno H, Norose K, Kamimura T, Mihara K, Yamasaki F, Hikosaka K, J Amatya V, Takeshima Y, Kurisu K, Maruyama H.
  • Journal Title: Intern Med Volume: 58 Pages: 1157-1162
  • NAID: 130007632763
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] The complete mitochondrial genome of Sarcoptes scabiei var. nyctereutis from the Japanese raccoon dog: Prediction and detection of two transfer RNAs (tRNA-A and tRNA-Y). (2019)
  • Author(s): Ueda T, Tarui H, Kido N, Imaizumi K, Hikosaka K, Abe T, Minegishi D, Tada Y, Nakagawa M, Tanaka S, Omiya T, Morikaku K, Kawahara M, Kikuchi-Ueda T, Akuta T, Ono Y
  • Journal Title: Genomics. Volume: - Pages: 1183-1191
  • DOI: 10.1016/j.ygeno.2018.09.002
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Serum lipidomics for exploring biomarkers of bortezomib therapy in patients with multiple myeloma (2019)
  • Author(s): Maekawa K, Ri M, Nakajima M, Sekine A, Ueda R, Tohkin M, Miyata N, Saito Y, Iida S.
  • Journal Title: Cancer Science Volume: 110 Pages: 3267-3274
  • DOI: 10.1111/cas.14178
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] Exploring the hepatitis C virus genome using single molecule real-time sequencing. (2019)
  • Author(s): Takeda H, Yamashita T, Ueda Y, Sekine A
  • Journal Title: World J Gastroenterol. Volume: 25 Pages: 4661-4672
  • DOI: 10.3748/wjg.v25.i32.4661
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] Comparison of the National Early Warning Score (NEWS) and the Modified Early Warning Score (MEWS) for predicting admission and in-hospital mortality in elderly patients in the pre-hospital setting and in the emergency department. (2019)
  • Author(s): Mitsunaga T, Hasegawa I, Uzura M, Okuno K, Otani K, Ohtaki Y, Sekine A, Takeda S.
  • Journal Title: PeerJ Volume: 7
  • DOI: 10.7717/peerj.6947
  • Peer Reviewed
• [Presentation] 臍帯血移植後に多発性脳出血を来したトキソプラズマ関連中枢神経系血管炎 (2020)
  • Author(s): 太田 貴徳，楠元 大岳，上野稔幸、上原康文、杉尾 康浩，田宮 貞史、 彦坂 健児，野呂瀬 一美，大野 裕樹
  • Organizer: 第42回造血細胞移植学会総会
• [Presentation] Traditional Kampo formula (漢方) Scutellaria-Coptis (瀉心湯)is protective against Toxoplasma infection via synergistic immunomodulation. (2019)
  • Author(s): Shinjyo N, Hikosaka K, Yoshida H, Norose K
  • Organizer: 第84回日本インターフェロン・サイトカイン学会学術集会
• [Presentation] PCR targeting the cytochrome c oxidase subunit 1 gene for clinical diagnosis of toxoplasmosis. (2019)
  • Author(s): Hikosaka K, Feng X, Koyama Y, Norose K.
  • Organizer: 4th Africa international biotechnology and biomedical conference, AIBBC
  • Int'l Joint Research
• [Book] 今日の診断指針 (2020)
  • Author(s): 野呂瀬 一美
  • Total Pages: 2079
  • Publisher: 医学書院
  • ISBN: 9784260038089
• [Remarks] 千葉大学大学院・医学研究院 中核研究部門 生命機能治療学研究講座 感染生体防御学
  • URL: http://www.m.chiba-u.ac.jp/class/infection-hostdefense/