ヒトパレコウイルス3型の受容体同定と感染重症化機序の解明
Project/Area Number |
19K08294
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Research Category |
Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
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Allocation Type | Multi-year Fund |
Section | 一般 |
Review Section |
Basic Section 52050:Embryonic medicine and pediatrics-related
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Research Institution | Niigata University |
Principal Investigator |
渡邉 香奈子 新潟大学, 医歯学系, 准教授 (80626094)
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Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
齋藤 昭彦 新潟大学, 医歯学系, 教授 (30531389)
樋口 雅也 金沢医科大学, 医学部, 教授 (50334678)
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Project Period (FY) |
2019-04-01 – 2024-03-31
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Project Status |
Granted (Fiscal Year 2022)
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Budget Amount *help |
¥4,290,000 (Direct Cost: ¥3,300,000、Indirect Cost: ¥990,000)
Fiscal Year 2021: ¥1,560,000 (Direct Cost: ¥1,200,000、Indirect Cost: ¥360,000)
Fiscal Year 2020: ¥1,430,000 (Direct Cost: ¥1,100,000、Indirect Cost: ¥330,000)
Fiscal Year 2019: ¥1,300,000 (Direct Cost: ¥1,000,000、Indirect Cost: ¥300,000)
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Keywords | ウイルス受容体 / 細胞への侵入 / ヒトパレコウイルス3型 / 蛍光タンパク質発現組換えヒトパレコウイルス3型 / CRISPR/ Cas9 / レトロウイルスベクター / cDNAライブラリー / パレコウイルスA / 新生児感染症 |
Outline of Research at the Start |
ヒトパレコウイルス3型(HPeV3)は、軽微な胃腸炎や上・下気道炎などの乳幼児感染症の原因ウイルスであるとともに、新生児あるいは早期乳児の敗血症様症候群や脳脊髄膜炎などの重症感染症に関与する。HPeV3が重症感染症を引き起こす分子機構は不明であり、これらを解明するためには、ウイルス受容体の同定が極めて重要な課題である。本研究では、HPeV3の受容体遺伝子をレトロウイルス発現クローニング法により同定する。更に、同定した受容体を発現する動物モデルを樹立し、個体レベルでのHPeV3感染症の分子機構を解析することにより、新生児において重症化する病態の全容解明を目指す。
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Outline of Annual Research Achievements |
ヒトパレコウイルス3型(PeV-A3)は、多くの場合、軽微な胃腸炎や上・下気道炎などをきたす乳幼児感染症の原因ウイルスである。しかしながら、PeV-A3が新生児あるいは早期乳児に感染すると、敗血症様症候群、脳脊髄膜炎などの重症感染症を発症し、4カ月未満児の入院率は7.5人/1,000人である。PeV-A3は腸管上皮もしくは気道上皮細胞などに感染すると考えられているが、感染機構、宿主細胞域の全体像、感染の組織特異性および重症感染症を引き起こす分子機構は不明である。 本研究ではPeV-A3のウイルス受容体を同定することによって、宿主細胞域や組織特異性を明らかにする。更に、同定した受容体を発現する動物モデルを樹立し、個体レベルでのPeV-A3感染症の分子機構を解析することにより、新生児において重症化する病態の全容解明を目指している。 ヒト由来PeV-A3高感受性細胞(HuTu-80)とヒト遺伝子をターゲットとするCRISPR/Cas9ライブラリーを用いてゲノムワイドランダムノックアウトスクリーニングを実施し、最も多くノックアウトされたMyeloid-associated differentiation marker (MYADM)遺伝子について検討を行った。 ハムスター由来のPeV-A3非感受性細胞(BHK-21)にMYADMを強制発現させたBHK-MYADM細胞にPeV-A3を感染させると、細胞変性効果(CPE)の出現と感染性ウイルスの産生が確認された。次に、HuTu-80細胞において、MYADM遺伝子をノックアウトしたMYADM-KO細胞ではCPEの出現と感染性ウイルスの産生は認められなかった。 PeV-A3以外のPeV-A1, A2, A4, A5, A6についてもMYADM-KO細胞とBHK-MYADM細胞への感染実験を行い、PeV-A3と同様の結果を得た。
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Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
FLAGタグを付加したMYADM遺伝子(FLAG-MYADM)の発現細胞とPeV-A3とを反応させ、FLAG抗体で免疫沈降することにより、FLAG-MYADMとPeV-A3のVP0とが、特異的に結合することが示された。 マウス由来のNIH/3T3細胞はBHK-21細胞と同様にPeV-A3非感受性であった。ヒトのMYADMは8回膜貫通タンパク質で、存在する4つの細胞外領域のうち最も長い第4細胞外領域にPeV-A3が結合すると考え、ヒトとマウスのMYADMの第4細胞外領域のみを置換したキメラ遺伝子を作製し、BHK-21細胞に導入してPeV-A3の感染実験を行った。PeV-A3はマウスMYADMをベースにしたヒトMYADMの第4細胞外領域を発現するBHK-F-MHM細胞に感染し、CPEの出現と感染性ウイルスの産生が確認された。一方、PeV-A3はヒトMYADMをベースにしたマウスMYADMの第4細胞外領域を発現するBHK-F-HMH細胞に感染しなかった。また、FLAGタグを付加したヒトMYADM遺伝子の発現細胞(BHK-NF-MYADM)とPeV-A3のVP0とが特異的に結合したが、マウスMYADM遺伝子の発現細胞(BHK-MF-MYADM)とは結合しなかった。更に、ヒトとマウスのキメラ遺伝子の発現細胞では、BHK-F-MHM細胞に結合したが、BHK-F-HMH細胞には結合せず、ヒトMYADMの第4細胞外領域に結合することが示された。
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Strategy for Future Research Activity |
今後は、ヒトMYADMを発現する動物モデルの樹立を試み、MYADMを介したPeV-A感染について解析を行い、新生児におけるPeV-A3感染症の重症化機構を明らかにする予定である。
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Report
(4 results)
Research Products
(15 results)