Detection of comprehensive viral infection after allogeneic hematopoietic stem cell transplantation using a nanopore sequencer
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19K08933
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| Research Category |
Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
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| Allocation Type | Multi-year Fund |
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| Section | 一般 |
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| Review Section |
Basic Section 54030:Infectious disease medicine-related
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| Research Institution | Oita University |
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Principal Investigator |
河野 利恵 大分大学, 医学部, 病院特任助教 (20468002)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
緒方 正男 大分大学, 医学部, 教授 (10332892)
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| Project Period (FY) |
2019-04-01 – 2024-03-31
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| Project Status |
Granted (Fiscal Year 2022)
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| Budget Amount *help |
¥4,290,000 (Direct Cost: ¥3,300,000、Indirect Cost: ¥990,000)
Fiscal Year 2022: ¥1,170,000 (Direct Cost: ¥900,000、Indirect Cost: ¥270,000)
Fiscal Year 2021: ¥1,040,000 (Direct Cost: ¥800,000、Indirect Cost: ¥240,000)
Fiscal Year 2020: ¥1,170,000 (Direct Cost: ¥900,000、Indirect Cost: ¥270,000)
Fiscal Year 2019: ¥910,000 (Direct Cost: ¥700,000、Indirect Cost: ¥210,000)
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| Keywords | ナノポアシークエンサー / 造血幹細胞移植 / 細菌感染 / 消化管粘膜障害 / ウイルス感染 / ウイルス感染症 / ヒトヘルペスウイルス６B / バクテリオファージ / 同種造血幹細胞移植 |
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| Outline of Research at the Start |
造血幹細胞移植後患者は極度の免疫不全状態に陥る。そのため、健常人では考えられないウイルス感染症を引き起こす。中には、ウイルス感染症が強く疑われるのにもかかわらず陰性の場合もある。
ナノポアシークエンサーには、膜状に配置されたタンパクポアをDNA分子が通過する際に生じる電流で配列を解析するという次世代シークエンサーと違った新しい原理が使用されている。ナノポアシークエンサーは、軽量、安価しかもハイスペックなコンピューターを必要としないという点より中規模病院施設でも使用可能である。本研究は、ナノポアシークエンサーを用いることにより簡便な造血幹細胞移植後の網羅的ウイルス感染検出を行う。
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| Outline of Annual Research Achievements |
2022年4月16日、2021年度研究室配属の学生（医学部５年生）が「医学生、研修医の日本内科学会ことはじめ2022（京都、Zoom）」で学会発表をおこなった。
タイトル:ナノポアシークエンサーを用いた網羅的感染微生物検出システムの開発、発表者:今井千絵（大分大学 医学部）
また、2022年度の研究室配属の学生が、造血幹細胞移植後患者：3名の移植前1週間から移植後70日の間の全血DNAの回収を行った。そのうち1名分の全血DNAをもちいてナノポアシークエンサーによる解析を行った。結果は、「主に多種類の腸内細菌が検出された。このうち、病原性を持つと考えられるのは大腸菌O157、赤痢菌、サルモネラ菌等であった。昨年（発熱が認められた時の検体）と比較すると菌数、菌種が少なく検出されday3にて一時的に多く増加した。」であった。
以上の結果から、「造血幹細胞移植患者では粘膜バリアの破綻により腸内細菌による敗血症が来されることが知られており、昨年度多種多様な腸管細菌が確認された理由として破壊された細菌DNAの血中へのtranslocationが考えられる。去年のデータと比較したとき、菌の種類が比較的少なく大腸菌以外が検出されることがほとんどないことが複数回あった。去年は熱発したときの血液から抽出したDNAをシークエンサーにかけたため細菌や真菌が多く検出されたと思われる。Day3にて一時的に多く菌種が増加した原因として口腔粘膜障害などがあったことから前処置に関連した副作用だと思われる。」という考察を行った。
2022年度には「造血幹細胞移植後患者1名分の全血DNAの解析」しかできなかったため、2023年度には残り2名分の解析を行い、「Day3の細菌DNAの増加がすべての患者にみられるか（前処置の影響であるか）」の検証を行う予定である。また、造血幹細胞移植後患者の熱発時の検体の解析も行う予定である。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
コロナウイルス検出のためのPCRキットと本申請の消耗品の大部分が同一のものである。そのため、2020年～2021年にかけてのコロナウイルス感染症流行時にほとんどの消耗品が手に入らなくなり、実験が大幅に遅れてしまった。特にRNA回収キットとフィルターチップの入荷ができないのは大きな痛手であった。さらに、ナノポアシークエンサー社のフロング（塩基配列の解読装置）が海外発注であり、物流の停滞のため最長発注から3か月待ちになってしまった。2021年、2022年と2年連続「医学生、研修医の日本内科学会ことはじめ」での発表は行っている。
研究の進捗がやや遅れているのは、実験がうまくいかずフロングの追加発注が必要となったのも遅れた原因の一つである。
3名分の経時的全血DNA回収をおこなったが、測定は1名になってしまった。
実験計画では、ウイルスの検出もターゲットとしていたがウイルスDNAは全く認められていない。予備実験（培養したウイルスを使用）では、予想通りのウイルス量が得られたのに反して、全血DNAからは全く認められなかった。そのため、の原因の検証も必要となった。
さらに予想に反して、消化器症状がないにもかかわらず腸内細菌のDNAが多数認められなかった。これは造血幹細胞移植前処置のための粘膜障害のため消化管細菌DNAが多数認められた」という仮説を立てている。これに関してもさらなる検証が必要である。
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| Strategy for Future Research Activity |
2023年5月より現在までストックしている「経時的に採取した造血幹細胞移植後患者全血DNAをナノポアシークエンサーで測定します。前年度に「移植後3日目に腸内細菌の種数、検出DNA量の増加」が認められています。他の2名にも同様の現象が認められるかの検証を行います。また、2024年度「医学生、研修医の内科学会ことはじめ」で発表予定です。
また、まだ測定をしていない造血幹細胞移植後熱発時の全血DNAを用いてナノポアシークエンスを行い、「熱発時に細菌、真菌種数とDNA量が増加するかを確認します。カルテ情報と照らし合わせて細菌、真菌種数とDNA量が増加が熱発時に使用した抗菌薬、抗真菌薬が原因であるかを検討していく予定です。
この「熱発時の検体」は、同時に多項目PCRによるウイルス量のチェックも行っています。そのため、ウイルスDNAが検出できない原因がナノポアシークエンサーの検出感度の問題かの検討できるようにしています。
ウイルスの検出が難しい原因が検出感度である場合には、ナノポアシークエンサーにアプライするサンプルの濃縮を試みます。方法としては磁気ビーズを使用することを考えております。
ここまでのデータをもとにして、英文雑誌への論文化を行う予定としております。
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Report
(4 results)
Research Products
(3 results)
