| Project/Area Number |
19K09107
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| Research Category |
Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
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| Allocation Type | Multi-year Fund |
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| Section | 一般 |
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| Review Section |
Basic Section 55010:General surgery and pediatric surgery-related
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| Research Institution | Toho University |
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Principal Investigator |
辻 昭一郎 東邦大学, 医学部, 非常勤研究生 (70726736)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
桑原 卓 東邦大学, 医学部, 准教授 (40385563)
田中 ゆり子 東邦大学, 医学部, 講師 (40396685)
近藤 元就 東邦大学, 医学部, 教授 (20594344)
森田 勇人 城西大学, 理学部, 教授 (50274303)
羽賀 博典 京都大学, 医学研究科, 教授 (10252462)
上本 伸二 京都大学, 医学研究科, 教授 (40252449)
加藤 悠太郎 藤田医科大学, 医学部, 教授 (70265833)
犬飼 美智子 藤田医科大学, 医学部, 助手 (00839186)
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| Project Period (FY) |
2019-04-01 – 2025-03-31
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| Project Status |
Granted (Fiscal Year 2023)
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| Budget Amount *help |
¥4,290,000 (Direct Cost: ¥3,300,000、Indirect Cost: ¥990,000)
Fiscal Year 2023: ¥260,000 (Direct Cost: ¥200,000、Indirect Cost: ¥60,000)
Fiscal Year 2022: ¥390,000 (Direct Cost: ¥300,000、Indirect Cost: ¥90,000)
Fiscal Year 2021: ¥650,000 (Direct Cost: ¥500,000、Indirect Cost: ¥150,000)
Fiscal Year 2020: ¥1,040,000 (Direct Cost: ¥800,000、Indirect Cost: ¥240,000)
Fiscal Year 2019: ¥1,950,000 (Direct Cost: ¥1,500,000、Indirect Cost: ¥450,000)
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| Keywords | 免疫寛容 / 移植 / マウス / アデノ関連ウイルス / 制御性T細胞 / リンパ球キメラ / PD-1 / IDO産生細胞 / ドナー特異的 / 肝移植 |
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| Outline of Research at the Start |
免疫抑制剤などの進歩により移植医療の成績は向上した。しかし免疫抑制剤による移植後の拒絶反応の制御は臓器提供者（ドナー）の抗原に対してのみならず外来微生物に対する免疫反応も抑制するため、免疫反応の制御が難しく、免疫抑制剤自身も腎毒性などの副作用があるため、ドナー抗原特異的な免疫制御が望まれている。
本研究ではドナーの抗原に対してのみ免疫反応がおきないドナー特異的免疫寛容が自然に成立するマウス肝移植モデルとアデノ関連ウイルスを用いてドナー特異的免疫寛容を導入するモデルを組み合わせることによりドナー特異的免疫寛容の機構を解き明かそうとしており、将来の免疫抑制剤を使用しない移植医療を目指している。
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| Outline of Annual Research Achievements |
2023年度は、2022年度に感染させた、GFPによる蛍光を指標としたAAVベクターの発現効率を確認する系について、感染条件の最適化を、１）感染経路の選択（腹腔内投与、尾静脈）、２）ウィルス作成に用いるHEK293T細胞の至適化（研究室で継代している株、TAKARA BI株）、さらに３）ウィルス作成用トランスフェクション試薬の選択（TransIT-293, TransIT VirusGEN）の条件で検討し、AAVベクターを介した肝臓での遺伝子発現の効率の最適化を試みた。
その結果１）については、肝臓での発現効率は尾静脈を経由して投与した方が選択的感染効率が高いこと、２）TAKARA推奨株を指定条件下で培養したHEK-293Tの方が、これまで使用してきた研究室での継代株よりもウィルス作成効率が50%程度高いこと、３）TranIT-293を用いてトランスフェクションを行うほうが、TransIT VirusGENを用いるより、ウィルス作成効率が高いことを確認した。また、トランスフェクションに用いるプラスミドは、市販の精製キットを用いるだけでなく、その後にCsClによる超遠心分離精製を行うことで、ウィルス作成効率が高まることを確認し、T225フラスコ1本あたり安定して1×10^11vg以上のAAVを作出することに成功した。
Balb/cマウスの肝臓をC57BL/6マウスに同所移植を行い、ALTを指標に肝障害の程度を評価し、評価するタイムポイントを設定した。移植成功例においてはUW液の有無による違いはなかったが、UW液未使用の場合は肝障害が高度で実験の継続が困難になるマウスの割合が増加するため、UW液は使用することで条件を統一した。また移植条件を同じくする目的で再還流までの時間も統一し、実験系の最適化を行った。その上でマウスの同所肝移植による免疫寛容の成立因子を免疫染織にて検討した。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
4: Progress in research has been delayed.
Reason
2023年度は比較的順調に研究が進展したが、2019年から新型コロナウイルス感染症が5類感染症に変更される2023年5月8日までの間、新型コロナウイルス感染症が流行するたび、あるいは勤務先の病院で発症するたびに実験が停止した影響で、全体としての研究の進行は遅れている。
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| Strategy for Future Research Activity |
2023年度の成果を用いて、H2-Kdの肝臓での発現を行ったマウスを2024年度に作成し、H2-Kdの発現効率の評価を行う。また遺伝子レベル、タンパク質レベルでの発現の確認を行い、免疫寛容の生理学的解析を行う予定である。
2024年度はPD-1ノックアウトマウスと抗PD-1抗体を用いて、AAV遺伝子導入モデルと肝移植モデルにおいてPD-1シグナルの免疫寛容の成立と維持における働きを解明していく。また経時的なTregの発現状況やアポトーシスの誘導との関係からTregの免疫寛容の成立のおける役割を解明する。AAVによる遺伝子導入後と肝移植後におけるリンパ球キメラの割合やその性質を比較することにより、免疫寛容におけるリンパ球キメラの状態を評価していく。さらにC56BL/6マウスのMHCであるH2-KbをH2-Kdに置換したC56BL/6-Kdマウスの作成を行う予定である。
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