Project/Area Number |
19K09836
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Research Category |
Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
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Allocation Type | Multi-year Fund |
Section | 一般 |
Review Section |
Basic Section 56040:Obstetrics and gynecology-related
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Research Institution | St. Marianna University School of Medicine |
Principal Investigator |
藤岡 仁美 聖マリアンナ医科大学, 医学部, 講師 (50410064)
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Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
萩原 裕子 聖マリアンナ医科大学, 医学部, 講師 (90468207)
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Project Period (FY) |
2019-04-01 – 2024-03-31
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Project Status |
Granted (Fiscal Year 2022)
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Budget Amount *help |
¥4,420,000 (Direct Cost: ¥3,400,000、Indirect Cost: ¥1,020,000)
Fiscal Year 2022: ¥910,000 (Direct Cost: ¥700,000、Indirect Cost: ¥210,000)
Fiscal Year 2021: ¥780,000 (Direct Cost: ¥600,000、Indirect Cost: ¥180,000)
Fiscal Year 2020: ¥1,040,000 (Direct Cost: ¥800,000、Indirect Cost: ¥240,000)
Fiscal Year 2019: ¥1,690,000 (Direct Cost: ¥1,300,000、Indirect Cost: ¥390,000)
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Keywords | GnRH / ミクログリア / ストレス / Kisspeptin / 機能性視床下部生性腺機能低下 |
Outline of Research at the Start |
機能性視床下部性性腺機能低下はストレスと関連があることが知られている。また、ストレスにより脳内で炎症反応が起こることも報告されている。本研究は、脳の免疫担当細胞であるミクログリアの活性化が、視床下部レベルで生殖機能を抑制するのかを検討することを目的とする。本研究は、脳内炎症によるLH分泌抑制機序を明らかにするものであり、ミクログリア活性化をターゲットとした治療法や創薬への貢献が期待される。
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Outline of Annual Research Achievements |
本年度は、昨年度に問題となったミクログリアへの低遺伝子導入効率を改善するため、AAVセロタイプの検討を行った。AAV-CAG-GFPをLE-Tg(OTTC1005) CX3CR1-Cre-ERT2ラット(ミクログリア/Mφ系細胞でタモキシフェン誘導によりCreリコンビナーゼが活性化する組換え遺伝子をラット)の線状体にAAV-CAG-GFPを投与したサンプルを用いて、ミクログリアのマーカータンパク質であるIba1に対する抗体で免疫染色を行い、ミクログリアにおけるGPFの発現を検討した。その結果、検討を行ったすべてのAAVセロタイプ(AAV-1, AAV-2、AAV-3、AAV-4、AAV-6.2, AAV-7, AAV-8)において、Iba-1陽性細胞でGFPの発現は観察されなかった。また、ミクログリアへの遺伝子導入が報告(Rosario et al, Mol Ther Methods Clin Dev. 2016, 3, 16026.)されているAAVTM6- Iba1-mCherry-DIO-DTAをAAV-CAG-GFPについても検討を行ったが、mCherryの発現はミクログリアでは観察されなかった。 原因として、ミクログリアに組換え遺伝子が導入されていない可能性、組換え遺伝子は導入されているがコピー数が少なく発現が弱い可能性などが考えられる。本年度に入りOkadaら(Commun Biol, 2022, 5, 1224)がAAV9を用いて、Linら(Nat Methods, 2022, 19, 976-985)がAAV.MG1.1, MG1.2セロタイプを用いて、マウスのミクログリアへの高率の遺伝子導入を報告した。来年度は、これらAAVセロタイプによるミクログリアへの遺伝子導入をラットで検討する予定である。
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Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
4: Progress in research has been delayed.
Reason
令和4年度は令和3年度に引き続き、LE-Tg(OTTC1005) CX3CR1-Cre-ERT2ラットを用いて、ミクログリアを操作する実験に着手する目的で、ミクログリアに効率に遺伝子導入できるセロタイプを選定するため、AAVベクターの投与実験を重ねたが、いまだミクログリアで導入遺伝子を発現させるに至っておらず、研究の進捗は遅れている。
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Strategy for Future Research Activity |
令和5年度は、Okadaら(2022, Commun Biol 5, 1224)やLinら(2022, Nat Methods 19, 976-985)がマウスのミクログリアへの高率の遺伝子導入を報告したセロタイプであるAAV9とAAV.MG1.1, MG1.2を用いて、ラットへミクログリアへの遺伝子導入を検討する。また、遺伝子発現を上げるためプロモーターをIba1プロモーターからSFFVに替えた、AAV-SFFV-mCherry-DIO-DTA投与による検討を行う予定である。ミクログリアへの遺伝子導入の条件が決定次第、速やかにミクログリアを特異的に除去する実験を、続いてDREADDによるミクログリア活性化を抑制する実験の検討を行う予定である。
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