免疫細胞を含む三次元培養皮膚モデルの構築と皮膚感作性試験法の開発

• Project/Area Number: 19K12802
• Research Category: Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
• Allocation Type: Multi-year Fund
• Section: 一般
• Review Section: Basic Section 90120:Biomaterials-related
• Research Institution: Osaka University
• Principal Investigator: 赤木 隆美 大阪大学, 生命機能研究科, 特任准教授(常勤) (00527236)
• Project Period (FY): 2019-04-01 – 2021-03-31
• Project Status: Discontinued (Fiscal Year 2020)
• Budget Amount: ¥4,290,000 (Direct Cost: ¥3,300,000、Indirect Cost: ¥990,000); Fiscal Year 2021: ¥1,040,000 (Direct Cost: ¥800,000、Indirect Cost: ¥240,000); Fiscal Year 2020: ¥1,560,000 (Direct Cost: ¥1,200,000、Indirect Cost: ¥360,000); Fiscal Year 2019: ¥1,690,000 (Direct Cost: ¥1,300,000、Indirect Cost: ¥390,000)
• Keywords: 組織工学 / 三次元生体組織 / 皮膚モデル / 動物実験代替法 / 交互積層 / 皮膚 / 動物実験代替

Outline of Research at the Start

細胞積層技術を用いて角化細胞からなる表皮層と線維芽細胞からなる真皮層で構成された三次元培養皮膚モデルを構築し、組織学的評価、タイトジャンクション形成評価、薬剤透過性等の機能評価を実施し、ヒト皮膚との相同性を精査する。また、真皮層に、血管、リンパ管、免疫細胞などの付属器を含有する機能性皮膚モデルを構築する。構築した各皮膚モデルを用いて、皮膚刺激性、感作性試験により動物代替評価システムおよび皮膚科学の研究ツールとしての有用性を実証する。特に免疫細胞を含む三次元皮膚モデルを用いた皮膚感作性のin vitro評価法を確立し、新たな動物実験代替法を確立する。

Outline of Annual Research Achievements

本研究では、細胞表面に細胞外マトリックス（ECM）からなるナノ薄膜を形成することで三次元組織体が構築可能な細胞積層（LbL）技術を用いて、血管、リンパ管、免疫細胞などの付属器を含む真皮層・表皮層からなる三次元培養皮膚モデル（LbL-3D Skin）を構築する。得られた皮膚モデルを用いて、動物実験代替システムとしての医薬品・化粧品・化成品の安全性、有効性評価に対する基盤技術を確立する。。令和元年度においては、血管網含有LbL-3D Skinの構造と機能について評価を行った。令和2年度においては、繊維芽細胞（NHDF）からなる真皮層を構築する際に、免疫細胞であるマスト細胞と共培養を行うことで、真皮層にマスト細胞を含有するLbL-3D Skinが構築し、刺激応答性を検討した。マスト細胞含有LbL-3D Skinとして、フィブロネクチンとゼラチン（FN-G）で交互積層したNHDF（1×10^6 cells）とマスト細胞（2×10^4 cells）を混合し、真皮層を構築した。その上にヒト正常ケラチノサイト（KC）を播種し、気液界面にさらすことで、KCを分化誘導させ、表皮層の形成を行った。7日間分化誘導後、マスト細胞の脱顆粒を誘導することが知られているCompound 48/80（50, 250 ug/mL）をマスト細胞含有LbL-3D Skinに添加し、6時間培養後の培地を回収した。回収した培地中のヒスタミン量をHPLCにより定量し、皮膚モデル全体に含まれるヒスタミン量から脱顆粒の割合を算出した。マスト細胞含有LbL-3D Skinを用いた脱顆粒試験の結果、Compound 48/80に応じた濃度依存的な脱顆粒が認められ、LbL-3D Skinの真皮層に導入したマスト細胞が脱顆粒惹起物質に反応し、アレルギー反応によってヒスタミンを産生することが明らかとなった。

Research Products

• [Presentation] 三次元培養全層皮膚モデルを用いた動物実験代替法および再生医療への取り組み (2020)
  • Author(s): 赤木隆美, 明石 満
  • Organizer: 第19回日本再生医療学会総会 （Web開催）
• [Presentation] 生体高分子の交互積層膜による細胞外環境制御と三次元組織構築 (2020)
  • Author(s): 赤木隆美, 明石 満
  • Organizer: 第69回高分子討論会 （Web開催）
• [Presentation] 三次元培養皮膚モデルLbL-3D Skinを用いた皮膚刺激性試験代替法のバリデーション研究 (2020)
  • Author(s): 赤木隆美, 村上将登, 宮崎裕美,田口浩之, 池田英史, 加藤雅一, 山田知美, Mura Simona, Couvreur Patrick, 足利 太可雄, 小島 肇, 明石 満
  • Organizer: 第33回日本動物実験代替法学会（Web開催）
• [Presentation] 交互積層法による細胞表面修飾と血管網含有三次元組織体の構築 (2019)
  • Author(s): 赤木隆美, 明石 満
  • Organizer: 第68回高分子学会年次大会
• [Presentation] 交互積層細胞コーティング技術を用いた三次元全層皮膚モデルの安定構築と皮膚刺激性試験代替法のバリデーション研究 (2019)
  • Author(s): 赤木隆美, 村上将登, 宮崎裕美, 田口浩之, 池田英史, 加藤雅一, 山田知美, Simona Mura, Patrick Couvreur, 足利 太可雄, 小島 肇, 明石 満
  • Organizer: 第68回高分子討論会
• [Presentation] Construction of 3D tissue models using layer-by-layer cell coating technique for drug development and regenerative medicine (2019)
  • Author(s): Takami Akagi, Mitsuru Akashi
  • Organizer: 第8回国際人工臓器学会学術大会
  • Int'l Joint Research
• [Presentation] 交互積層細胞コーティング技術を用いた三次元全層皮膚モデルの構築と皮膚刺激性試験バリデーション研究 (2019)
  • Author(s): 赤木隆美, 村上将登, 宮崎裕美, 田口浩之, 池田英史, 加藤雅一, 山田知美, Simona Mura, Patrick Couvreur, 足利 太可雄, 小島 肇, 明石 満
  • Organizer: 日本動物実験代替法学会第32回大会